猪伪狂犬病病毒四川株的分离鉴定及UL43基因序列分析

从四川某猪场发病仔猪体内分离到1株病毒,该毒株能在Vero、MDBK、PK15、ST、MDCK、BHK21、Marc145、鸡胚成纤维细胞(CEF)上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化,克隆毒株在Vero细胞上为3.0×107TC ID50/0.1mL。该病毒在Vero细胞上连传15代,其TCID50变化很小。病毒对5-溴脱氧尿核苷、氯仿敏感。用该病毒接种家兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状,gE-ELISA检测接种分离毒的仔猪血清,伪狂犬病毒(PRV)抗体阳性。电镜观察可见直径110～140 nm的典型疱疹病毒粒子。上述结果表明分离株为PRV,并命名为SE株。根据已发表的UL43序列设计1对引物,以分离毒株基因组DNA为模板进行PCR扩增,对目的产物进行克隆及测序分析,结果与GenBank收录的其他PRV毒株(Becker、Ea)的UL43核苷酸序列同源性为98.8%,氨基酸同源性分别为95.2%、97.3%。     

云南省红河州猪伪狂犬病病原分离鉴定

从云南省红河州猪繁殖障碍症较为严重的部分地区大批死亡的新生仔猪和流产胎儿的脑及内脏中分离到了2株病毒。该病毒株在猪肾传代细胞PK-15和兔肾传代细胞RK-6上连传9代均出现典型细胞病变;病毒测定在PK-15细胞上的半数感染量为10-7.3/0.1ml;该病毒能被PRV标准阳性血清中和;病毒接种家兔和小白鼠均出现典型的伪狂犬病症状。从细胞分离物中提取DNA作为模板,应用PRV特异性引物,进行聚合酶链式反应扩增,两株毒株均出现长约262bp的目标扩增条带,与阳性对照一致。结果表明,所分离病毒为伪狂犬病病毒,并将该毒株命名为猪PRV/HH06株和PRV/HH09株。     

潍坊某猪场一起伪狂犬病的诊治

2014年9月山东潍坊某猪场发生疑似猪伪狂犬病疫情,采集病死仔猪的脑组织等,利用Vero细胞做病毒分离,并设计一对伪狂犬病病毒(PRV)g E基因片段的特异性引物对分离病毒进行PCR鉴定及家兔接种试验。结果表明:脑组织上清液接种Vero细胞后有典型的细胞病变;PCR扩增产物电泳后显示出990bp长的目的片段,目的片段基因序列与6株PRV毒株的g E基因序列核苷酸同源性在97.7%~100%之间,证实该病毒为PRV;分离病毒接种家兔出现典型的伪狂犬病症状。临床诊断结合实验室鉴定以及动物接种试验,确诊该病例为猪伪狂犬病。     

猪伪狂犬病病毒AH02LA株的分离鉴定及其对仔猪致病性研究

从安徽六安某爆发伪狂犬病猪场送检的流产仔猪脑组织样品中分离获得1株病毒,经鉴定为伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),命名为PRV AH02LA株。PRV AH02LA株的糖蛋白g D和g I基因序列与2011年以来我国分离的变异株同源性最高(99.5%~100%),而与其他毒株同源性低。该分离株在BHK21细胞上增殖能力强,最高滴度达到109.0TCID50/m L。该分离株对4~5周龄和9~10周龄的PRV阴性猪能引起100%发病和死亡。临床上4~5周龄猪有严重的神经症状,也有明显的呼吸道症状;而9~10周龄猪主要表现呼吸道症状。说明本研究分离获得的PRV AH02LA是一株伪狂犬病毒变异株,其对仔猪的致病力较强。     

猪伪狂犬病病毒GXBB株的分离鉴定及gE基因的克隆分析

从广西玉林博白某猪场采集的发病仔猪大脑和内脏病料中分离到一株病毒。病毒接种家兔后引起典型的奇痒、神经症状,接种PK-15细胞出现典型的细胞病变,病毒效价（TCID₅₀）为10^-7.22/0.1 ml。设计扩增PRV gE胞外区基因的引物,能扩增出约947 bp的特异性片段,将扩增出的目的片段进行克隆、测序,并与国内外不同PRV毒株进行分析比较,发现该毒株与国内MinA株、Ea株、SH株、LA株、GXB株、GXW株核苷酸同源性在98.7%～99.4%之间,氨基酸同源性在98.1%～99.1%之间,上述结果证实该分离毒株为伪狂犬病病毒,命名为GXBB株。GXBB株与国内流行毒株同源性很高,说明目前广西PRV流行株变异不大。这为下一步广西伪狂犬病的预防和净化工作提供科学的理论基础。     

山东省某规模猪场猪伪狂犬病毒变异毒株的分离与鉴定

2015年山东省烟台市某免疫伪狂犬病疫苗Bartha-K61猪场暴发疑似伪狂犬病疫情,临床表现为妊娠母猪繁殖障碍,仔猪神经症状。脑组织病料样品接种BHK21细胞,分离获得1株伪狂犬病病毒(PRV),命名为PRV-YT株。该病毒株gE基因与JS-2012、HN1201和ZJ01株序列同源性为99.4%～99.8%,且位于同一遗传进化分支。选择70日龄PRV阴性健康猪接种PRV-YT株,发病率和死亡率均达100%(5/5),均表现严重脑组织、肝脏与肺脏损伤,表明PRV-YT株为猪伪狂犬病病毒变异强毒株。本研究为制定猪伪狂犬病防控方案提供了重要基础。     

猪伪狂犬病毒DQ株的分离鉴定和生物学特性的研究

从黑龙江大庆某猪场采集流产死亡的仔猪大脑、扁桃体等病料组织接种BHK-21细胞,分离到1株病毒,经PCR检测、直接荧光法检测,血清中和试验,证实分离到的病毒为伪狂犬病毒,命名为PRV DQ株,该病毒经克隆纯化后测得其毒价为108.36TCID50/ml,对热、胰蛋白酶、氯仿、乙醚敏感,15日龄哺乳仔猪接种该分离株后发病死亡。     

猪伪狂犬病病毒HN2012株的分离鉴定及gE基因遗传进化分析

2012年以来,由新型猪伪狂犬病病毒引起的猪伪狂犬病(PR)在我国规模化猪场大范围发生,在河南省发病猪场分离到1株PRV,命名为HN2012。该病毒在BHK-21细胞中能够产生典型的PRV细胞病变,将HN2012以10~5 TCID50的剂量感染成年家兔,接种兔在36h内全部死亡,均出现典型的PR症状。序列比对结果表明,HN2012与其他毒株同源性为94.82%~99.83%。进化树分析结果显示,PRV gE进化方向分为国内分离毒株和国外分离毒株两支,中国分支明显划分为2012年前分离毒株亚群和2012年后分离毒株亚群。这些结果对于我国PR的预防和疫苗株的选择具有重要的参考价值。     

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒，对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞(RK)上和鸡胚成纤维细胞(CEF)上连传5代．均出现典型细胞病变．再接种于RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK15细胞和143TK细胞，均出现典型细胞病变；在RK-13细胞上的TCID50为10^-0.52/0．1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子；对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；病毒接种于家兔和小鼠，均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA作为模板。应用特异性引物，以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gD基因中272～534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明，所分离病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁A株。     

猪伪狂犬病病毒HB-11株的分离鉴定及gC基因的分析

将某猪场发病死亡猪的脑和肺组织接种BHK-21细胞,连传5代均出现典型细胞病变,表明分离到1株病毒,病毒含量为108. 33TCID50/mL。该毒株能被猪伪狂犬病病毒标准阳性血清中和,接种家兔、小鼠和仔猪均出现典型伪狂犬病症状,表明分离株为猪伪狂犬病病毒,命名为PRV HB-11株。gC基因的遗传进化分析显示,HB-11株与近年来流行的变异株同源性为99. 3%~99. 4%,与Bartha株的同源性为94. 8%,其gC基因序列相对于Bartha株序列有7个连续氨基酸的插入(158AAASTPA164),该突变插入的生物学意义有待于进一步研究。     

伪狂犬病毒GDSH株的分离鉴定及gE基因的序列分析

从广东四会某猪场分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)的病毒,病毒在猪肾细胞上出现细胞变圆、拉网、融合等典型病变,并具有细胞泛嗜性特点。在MDCK细胞上测得其TCID50值为10-8/0.1mL,能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。将0.1mL病毒液接种小鼠后发生奇痒并麻痹致死,接种猪3天后发病,7天死亡,从攻毒病死猪的脑组织病理切片上观察到典型的病毒性脑膜脑炎及血管套现象。通过PCR扩增到PRVgD基因,由此进一步证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒,并命名为GDSH株。根据GenBank中发表的序列,设计一对扩增PRVgE基因的特异性引物,建立可以区分PRV野毒株与疫苗株的PCR诊断方法。以此方法对病毒的细胞培养液进行检测,结果证实所分毒株为PRV野毒株,经克隆测序后与GenBank收录的其它PRVgE基因序列进行比较,发现所测毒株的核苷酸序列与其它PRV毒株的同源性介于98.3%～99.9%之间,其中与PRVEa株的亲缘关系最近为99.9%。     

猪伪狂犬病毒TK缺失株PRV/TK~-的构建及其生物学特性

为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研...     

一株水貂源伪狂犬病毒株的分离鉴定

从辽宁大连疑似水貂伪狂犬病发病死亡水貂脑、内脏中及饲喂的猪肝中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种BHK-21细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据Gen Bank公布的PRV的Tg ET基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病毒g E基因序列。以上结果表明,该病毒为伪狂犬病毒,依据来源确定为水貂源性伪狂犬病病毒株。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离鉴定及gE基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异毒株的特点,本研究采集临床疑似PRV感染发病猪的淋巴结等组织样品进行PCR鉴定,选取仅PRV阳性的组织样品经研磨除菌后取上清接种于PK-15细胞进行病毒分离培养、蚀斑纯化、PCR和间接免疫荧光法（IFA）鉴定,采用Reed-Muench法测定PRV的TCID₅₀,接种小鼠并观察临床症状,对纯化的PRV和死亡小鼠脑组织样品进行gE基因PCR扩增及测序分析。结果显示,PRV阳性病料接种于PK-15细胞24 h后出现典型细胞病变（CPE）,经3轮蚀斑纯化后PCR和IFA鉴定结果均为阳性,分离株命名为HeNZK-2014,其TCID₅₀为10^-9.77/0.1 mL;以1×10⁸个TCID₅₀病毒悬液接种小鼠22 h后可引起小鼠出现奇痒、撕咬、死亡等典型猪伪狂犬病症状,死亡小鼠脑组织样品PRV PCR检测结果为阳性;纯化病毒和死亡小鼠脑组织样品gE基因核苷酸序列同源性为100.0%,与GenBank中2011年以前登录的经典毒株位于不同分支,与2011年之后中国流行毒株位于同一分支,在第48和496位各有1个天冬氨酸（D）的插入,具有变异毒株的典型特征。本研究成功分离了1株PRV变异毒株,为进一步开展针对PRV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒CC株的分离与鉴定

从吉林省长春市某猪场送检的一头发热、流涎、肌肉痉挛、角弓反张的9日龄仔猪中分离到一株病毒。该病毒能在猪肾细胞(PK-15)，仓鼠肾细胞(BHK-21)和非洲绿猴肾细胞(Vero)增殖并产生典型的细胞病变(CPE)，从流行病学，临床症状和病理变化均与伪狂犬病相似，该病毒能被伪狂犬病毒阳性血清中和，电镜观察可见椭圆形、直径为110-180nm典型疤疹病毒粒子，用该病毒接种家免和小白鼠均出现典型的伪狂犬病症状。经鉴定，证明此病毒确为伪狂犬病病毒(PRV)，并将该病毒命名为PRVCC株。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

从福建省某猪场疑似伪狂犬病的发病3日龄仔猪的脑、肺脏中分离到1株病毒.该病毒接种家兔出现了典型的伪狂犬病症状,接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等典型的细胞病变,猪伪狂犬病病毒阳性血清能特异性中和该分离病毒.根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列,设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增特异性298 bp的DNA片段.测序结果与GenBank中有代表性的6株参考毒株相应基因序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.5%~99%和91.8%~98%.系统进化树结果表明分离株与湖北分离株Ea株亲缘关系最近.     

猪伪狂犬病病毒FZ株的分离鉴定

从福州郊区某猪场发生疑似伪狂犬病的仔猪中分离到一株病毒。该病毒株感染Vero细胞、MDCK细胞均可产生典型的细胞病变,并可见合胞体。感染仔猪症状较轻,但在攻毒后25d,可检测到伪狂犬病抗体,并在仔猪的肺气管冲洗液中回收到同样理化特性的病毒。接种成兔和小白鼠均可出现典型的伪狂犬病症状。电镜观察可见110～180nm大小不等、不规则圆形、有囊膜的伪狂犬病毒粒子。用MDCK细胞测定其TCID50为10-6.604/0.1mL,能被PRV标准阳性血清所中和,效价为1∶77。对乙醚、热、胰蛋白酶敏感,在pH5.0～9.0之间保持稳定。尿囊膜接种9～12日龄鸡胚,86h可见尿囊膜水肿、出血,有大小不一白色痘斑样病灶,胚体萎缩,头盖部突起、全身弥漫性出血。制作细胞飞片,8h用PRV荧光抗体染色,可观察到细胞浆内呈现散在的翠绿色荧光。PCR反应可扩增出特异性1579bpDNA片段。证实分离的病毒株为伪狂犬病病毒,并命名为PRVFZ株。     

猪伪狂犬病病毒新W株的分离与鉴定

从新疆五家渠、石河子某猪场病死仔猪的大脑和内脏组织中分离到一株疑为猪伪狂犬病病毒 ( PRV)毒株 ,通过兔体接种、BHK-2 1细胞培养、理化特性测定、中和试验、实验兔和仔猪回归试验、电镜观察、PCR扩增及感染力测定 ,分离的病毒接种实验兔后发生奇痒并麻痹致死 ;BHK-2 1细胞培养盲传 4代出现典型细胞病变 ;电镜观察可见病毒粒子呈圆形并带有囊膜和纤突 ;回归兔出现典型奇痒症状 ,仔猪出现典型的症状和病理变化 ;分离的病毒能被 PR鄂 A株标准阳性血清中和 ;该病毒对氯仿、乙醚、酸、热敏感 ;PCR体外扩增可见其与鄂 A株在同一水平位置上有相同的电泳带 ;用 BHK-2 1细胞测定其毒价 TCID50 为 10 -1 0 .87/0 .1m L 根据此分离病毒株的上述特性 ,鉴定其为伪狂犬病病毒     

猪伪狂犬病病毒HP-SY2022株的分离鉴定

为了解猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒株的特点,本研究对沈阳某养殖场疑似感染PRV的组织病料进行PCR鉴定、病毒分离和纯化、gD、gE基因序列测定及分析、动物回归实验。结果显示：分离株能在ST细胞中产生典型的细胞病变,且PCR显示为PRV阳性;通过gD、gE基因进行序列分析发现,分离株与2011年后分离的PRV变异株位于同一进化分支;氨基酸位点分析发现分离株与PRV变异株具有相同的变异模式。进一步研究其致病性,将纯化后的病毒液接种PRV抗体阴性21日龄健康仔猪,感染仔猪出现典型的PR症状,如呼吸困难、转圈、流涎和划水动作,且在试验期内仔猪全部发病(5/5),其中4头死亡(4/5)。综上,本研究成功分离到一株PRV变异株,将其命名为HP-SY2022。这一研究为丰富我国PRV分子流行病学及后续的免疫防控提供了参考。     

猪伪狂犬病病毒北京株的分离鉴定

从北京某猪场疑似猪伪狂犬病发病死亡仔猪脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种ST细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据GenBank公布的PRV的gD基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病病毒基因序列。以上结果证实该病毒为猪伪狂犬病病毒,依据分离地点命名为猪伪狂犬病病毒北京株。