鸡IL-18真核表达质粒与新城疫病毒F基因疫苗联合免疫探讨

为探讨鸡IL-18基因真核表达质粒pcDNA-chIL-18在新城疫病毒(NDV)F基因疫苗免疫中的作用,克隆了新城疫病毒标准株F48E9的F基因,构建F基因重组真核表达质粒pcDNA-F;将11日龄试验鸡分为4组,每组10只,14日龄一免,28日龄二免,分别肌注pcDNA-F、pcDNA-F+pcDNA-ckIL-18、新城疫传统疫苗(14日龄NDV弱毒疫苗首免,28日龄NDV油苗二免)、生理盐水,一免疫后第7、14、21、28 d均采血进行ND抗体(ELISA)检测和T淋巴细胞转化(MTT)试验;第29 d均肌注50LD50NDV强毒F48E9株.结果显示:免疫保护效率,生理盐水组0/10,pcDNA-F免疫组3/10,pcDNA-F+pcDNA-chIL-18免疫组5/10,新城疫传统疫苗免疫组10/10;ND抗体水平,pcDNA-F免疫组与pcDNA.F+pcDNA-chIL-18免疫组无差异(P>0.05),均显著低于传统疫苗免疫组(P<0.05);T细胞转化水平,pcDNA.F+pcDNA-cML-18免疫组明显高于pcDNA-F免疫组(P<0.05),pcDNA-F免疫组与传统疫苗免疫组无差异(P>0.05).试验结果综合显示pcDNA-F免疫试验鸡可产生一定程度的免疫保护;pcDNA-chIL-18对pcD-NA-F具有一定的免疫增强作用.     

磷酸铝和鸡IL-18在新城疫F基因疫苗中的免疫佐剂作用(英文)

[目的]研究磷酸铝、鸡IL-18分子佐剂pcDNA/chIL-18对新城疫F基因pcDNA/F的免疫佐剂作用。[方法]制备每份(0.2ml/只)含有磷酸铝佐剂(90μg)、pcDNA/F(200μg)、pcDNA/chIL-18(200μg)的疫苗,将实验鸡随机分为6组,每组12只,于7d龄分别肌注新城疫灭活疫苗、pcDNA/F+pcDNA/chIL-18+磷酸铝、pcDNA/F、pcDNA/F+pcDNA/chIL-18、pcDNA/F+磷酸铝、生理盐水;21d龄时以相同剂量进行2免。分别于免疫后0、7、14、21、28d采血,用ELISA检测其抗体水平,以淋巴细胞转化试验(MTT)方法检测T细胞转化率。35d龄时用30LD50的NDV强毒进行攻毒保护试验。[结果]pcDNA/F+磷酸铝+pcDNA/chIL-18免疫组的近期攻毒保护率达8/12,明显高于pcDNA/F组的保护率4/12和pcDNA/F+pcDNA/chIL-18组的保护率6/12;在ND抗体水平上,pcDNA/F+磷酸铝免疫组、pcDNA/F+pcDNA/chIL-18免疫组与pcDNA/F+pcDNA/chIL-18+磷酸铝免疫组无差异(P>0.05),均显著低于传统疫苗免疫组(P<0.05);pcDNA/F+pcDNA/chIL-18+磷酸铝免疫组的T细胞转化水平明显高于pcDNA/F免疫组(P<0.05),而pcDNA/F免疫组与传统疫苗免疫组无差异(P>0.05)。[结论]磷酸铝和pcDNA/chIL-18佐剂共同作用能明显提高NDVF基因疫苗的免疫作用。     

新城疫La Sota疫苗对不同基因型流行株的免疫保护

选取国内2001—2003年发生的5株NDV毒株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,克隆其融合蛋白（F）和血凝素—神经氨酸酶（HN）基因。利用F基因为Ⅱ型的疫苗La Sota活疫苗在隔离器中免疫SPF鸡,每7 d 采血监测NDV抗体,免疫后2周,利用经过鉴定的新城疫病毒（NDV）基因Ⅶ流行株潍坊毒SGM01,昌乐毒SCL03,东营毒SKY和莘县毒SSX03;基因为Ⅱ型日照毒SRZ03和基因为Ⅲ型经典强毒F48E9分别进行攻毒试验,同时设SPF 鸡对照。每天观察,及时剖检发病鸡,检查鸡群病变,观查疫苗的保护性,便于对常规生产中的免疫失败原因进行分析。     

新城疫疫苗对近年流行毒株的保护作用

[目的]了解现有新城疫疫苗对近年流行新城疫病毒(NDV)毒株的保护效果,从而为新城疫疫苗的合理应用和新城疫的防制提供指导。[方法]用1个或0.01个使用剂量的鸡新城疫弱毒活疫苗A、B、C、D、E经滴鼻、点眼、口服途径分别免疫6周龄SPF鸡。免疫14 d后,测定血清中HI抗体效价,同时分别用NDVF48E9标准强毒株和野外分离强毒株NDV-2007-HB、NDV-2008-YB攻毒。连续观察攻毒鸡的表现并统计发病和死亡情况。[结果]5种疫苗免疫14 d后,均可诱导鸡只产生保护水平的抗体。1个剂量或0.01个剂量的现有疫苗对NDVF48E9株的攻毒保护率均为100%,对NDV-2007-HB的攻毒保护率均大于90%;0.01个剂量的疫苗A、B、C可提供对NDV-2008-YB的攻毒保护率均大于90%。[结论]实验室条件下,现有新城疫疫苗对分离到的2株NDV毒株具有较好的保护效果,能预防鸡新城疫的发生。     

昆虫细胞表达基因Ⅶ NDV HN基因的免疫效力研究

利用杆状病毒表达系统对ⅦNDV HN基因进行表达研究。RT-PCR扩增HN基因,将其克隆到p Fast Bac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含HN基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组HN蛋白保护性。结果显示,目的蛋白HN在昆虫细胞中有特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;强毒攻击保护率达到75%,与La sota疫苗组保护率接近,均明显高于阴性对照组。上述结果为NDV新型亚单位疫苗奠定了基础。     

鹅副黏病毒HN基因真核表达载体在小鼠中的免疫效果

以大量提取的鹅副黏病毒(GPMV)HN基因真核表达载体pVAXⅠ-HN和空载体pVAXⅠ肌肉注射BALB/c小鼠。利用MTT法检测免疫小鼠的T细胞增殖活性,用ELISA方法检测小鼠血清中GPMV抗体,观察GPMV HN基因真核表达载体pVAXⅠ-HN在小鼠中的免疫效果。结果表明:试验组小鼠血清中GPMV特异性抗体水平显著高于对照组,ELISA试验结果OD492值分别为1.360 0±0.101 7和0.358 0±0.018 1;试验组与对照组的淋巴细胞增殖试验刺激指数(SI)差异不显著,其SI值分别为1.181 2±0.030 1和1.119 1±0.035 5。由此说明,GPMV HN基因真核表达载体可以诱导小鼠产生明显的体液免疫。     

硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响

试验Ⅰ:免疫应答试验:取450只雏鸡随机均分为9组,在14日龄用新城疫Ⅳ系疫苗免疫,同时分别肌肉注射高、低剂量的3种硫酸化香菇多糖(sLNT_1、sLNT_2、sLNT_3)和香菇多糖(LNT)。分别于首免前和首免后连续6周检测血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的动态变化。试验Ⅱ:免疫保护试验:取350只雏鸡随机均分为7组,除非免疫组外其余组用新城疫Ⅳ系疫苗免疫,同时3个sLNT组和LNT组分别注射sLNT_1、sLNT_2、sLNT_3和LNT。于免疫后第21天,除无佐剂对照组第2组外各组鸡均肌肉注射NDV强毒攻毒,观察保护效果,并分别于攻毒前和攻毒后第3、6、9、12和15天测定血清HI抗体效价和外周血T淋巴细胞增殖的动态变化。结果表明:3种sLNT在首免后28 d内比LNT显著提高血清抗体效价最高2个滴度(高剂量的效果优于低剂量),促进淋巴细胞增殖(低剂量的效果强于高剂量);攻毒鸡发病率和死亡率降低,保护率提高最多达17.5%,加速攻毒后血清抗体生成和T淋巴细胞增殖,病鸡最快可以在攻毒后6 d恢复正常。综合评价以sLNT_2的效果最好。揭示:硫酸化修饰能显著提高LNT的免疫增强活性,增强新城疫疫苗的...     

新城疫病毒F和HN基因真核表达载体的构建

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F、HN基因序列和真核细胞表达载体pEGPF-N1的克隆位点,分别设计一对引物,通过PCR方法获得了F、HN基因,经回收纯化,将产物连接到克隆载体pMD18-T上。酶切鉴定和序列分析后,再将目的基因亚克隆到真核细胞表达载体pEGPF-N1上,经鉴定,成功构建含有NDVF和HN基因的真核细胞表达载体pEGPF-N1-F和pEGPF-N1-HN,为下一步研究NDVF和HN蛋白在细胞凋亡中的生物学功能奠定基础。     

感染鸡贫血病毒雏鸡接种新城疫疫苗后免疫保护效应及其机理研究

 雏鸡 1日龄人工感染鸡贫血病毒 (CAV) ,于 8日龄接种 L asota疫苗 ,免疫后 2 8d进行新城疫强毒 (v NDV)攻击 ,以同龄未感染 CAV和用 L asota疫苗免疫并经 v NDV攻毒雏鸡为对照 ,检测其免疫保护效应 ,胸腺和脾脏 T细胞数量及 T细胞增殖反应 ,法氏囊和脾脏 Ig G+、Ig M+、Ig A+抗体生成细胞数量 ,血清免疫球蛋白 Ig G、Ig M、Ig A含量 ,血凝抑制抗体 (HI)滴度等。结果表明 ,CAV人工感染并用新城疫 (ND)疫苗免疫雏鸡经 v NDV攻击后的免疫保护率为 6 0 % ,对照组雏鸡 v NDV攻击后免疫保护率为 10 0 % ,胸腺和脾脏 T细胞数量和 T细胞增殖反应、法氏囊和脾脏Ig G+ 、Ig M+ 、Ig A+ 抗体生成细胞数量、血清 Ig G、Ig M、Ig A含量及 HI抗体滴度 ,均较对照组雏鸡显著降低。说明感染鸡贫血病毒雏鸡接种新城疫疫苗后的免疫保护效应及免疫功能明显降低。     

鸽新城疫油乳剂灭活疫苗的研制

鸽新城疫(PND)是一种高度接触性、败血性传染病,对养鸽业有巨大威胁.为了控制本病的发生,利用从当地鸽群分离的鸽新城疫病毒,研制了鸽新城疫油乳剂灭活疫苗,并对该疫苗的安全性、免疫效力、免疫期及保存期等进行了研究.结果表明:该疫苗使用安全,无不良反应;具有良好的免疫原性,免疫21 d攻毒保护率达100%;免疫期可持续6个月,免疫7个月攻毒保护率达80%以上;在2～8 ℃条件下保存有效期可达12个月,保存15个月进行效力检验,攻毒保护率仍达80%以上.     

新城疫病毒洛阳分离株HN基因真核表达载体的构建

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从新城疫病毒洛阳分离株中扩增出HN基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA3真核表达载体上,构建pcDNA3-HN重组质粒。通过用PCR扩增、酶切电泳分析的方法对重组DNA进行鉴定,成功构建了新城疫病毒洛阳分离株HN基因真核表达载体。     

鸡新城疫病毒F基因部分片段克隆表达及其抗体制备

[目的]为进一步研究新城疫病毒的分子结构和基因疫苗奠定基础。[方法]用自行设计的l对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因部分片段,将该基因片段插入含谷胱甘肽(GST)基因的质粒pGEX-4T-1,构建了重组质粒,对提取的融合蛋白进行亲和层析纯化和琼扩、ELISA及W estern-blot检测。[结果]通过克隆和PCR扩增获得新城疫病毒F基因的部分片段,大小为509 bp;对构建的重组质粒pGEX-4T-1-F509经诱导表达,获得分子大小约为44 000 bp的融合蛋白,其中F基因的部分片段大小约18 000 bp;经亲和层析,获得纯化GST-F509融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗鸡新城疫病毒F蛋白抗体。[结论]琼脂扩散试验、ELISA及W estern-blot检测表明,该融合蛋白中的F片段具有良好的抗原性。     

一株新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析

以RT-PCR扩增新城疫病毒JZ05株的HN基因,并进行克隆和测序.采用DNAssist序列分析软件将JZ05毒株HN基因与另外18个NDV毒株HN基因序列及其氨基酸序列进行比对分析.测序结果表明,JZ05毒株的HN基因全长1716 bp,HN蛋白由571个氨基酸残基构成,具有5个潜在糖基化位点及13个半胱氨酸残基,第6个潜在糖基化位点(538-540 aa)发生缺失.与另外18个NDV毒株比对,仅NDV JZ05株发生单个氨基酸残基变更的有6处.与11个毒株(ZJ1、TJ03、Jlan-1-00、SBZ02、SCL03、JS02、GD05、SQD04、SQZ04、YG、Taiwan95)比对,HN基因序列及其氨基酸序列的同源性均在94%以上;但与3个疫苗毒株(Clone30、LaSota、B1)比对,基因序列的同源性约82%,氨基酸序列的同源性约87%.     

新城疫病毒HN基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT—PCR方法扩增新城疫病毒HN基因并将其克隆至T载体,测定其核苷酸序列。尔后用PCR扩增球状头部编码区,并将其克隆至pSOC质粒soc基因3端EcoR Ⅰ位点,重组质粒pSOC—HN转化E．coli BL-21(DE3)感受态细胞。以终浓度1mmol／L的IPTG诱导表达,在SDS—PAGE凝胶上可检测到分子量约67KD的融合蛋白特异条带,west—blot证实表达产物与NDV抗血清具有良好的反应性。     

新城疫病毒F48E9株HN蛋白抗原结构域区段的原核表达

利用生物软件对新城疫病毒F48E9株的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定172～570位氨基酸区域作为多肽表位候选区域。以pUC18-F-HN为模板,设计引物通过PCR扩增,获得HN抗原结构域基因片段,SaⅠl、NoⅠt双酶切定向克隆到原核表达载体pET28a,获得重组质粒分别命名为pET28a-HNa。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析。结果表明,HN抗原结构域基因片段获得了融合表达,Western-blotting分析证实表达产物HN与NDV阳性血清具有免疫反应性。为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白相互作用奠定了基础。     

鹅源新城疫病毒F和HN基因的表达及功能鉴定

鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2．1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN)。间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体。而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关。     

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

 【目的】重组新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒（very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV）及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21 d分别以vvIBDV Gx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV－VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120 h,脑内致病指数（ICPI）分别为0.4和0.36,静脉内致病指数（IVPI）均为0;接种后72～96 h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0 EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100％保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90％以上。 【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病－新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。     

商品蛋鸡新城疫免疫技术研究

通过对比不同鸡新城疫（ND）疫苗免疫商品蛋鸡后HI抗体的消长规律,确立了ND弱毒苗＋ND灭活苗联用是商品蛋鸡首选的疫苗组合,并制定了ND最佳免疫程序（8日龄首免→60日龄二免→120日龄三免→以后每隔3个月免疫1次）。经田间试验和小区应用试验证实,将该ND免疫程序加入常规免疫程序中,其免疫效果基本不受其他疫苗免疫等因素干扰;在不同养鸡场实施该免疫程序,其免疫效果差异不显著。因此建议大面积推广应用。