水禽传染病专题导读：加强水禽传染病的防控技术研究和技术储备

中国是世界水禽生产和消费大国，20世纪80年代以来，水禽产业发展速度较快，饲养量平均每年以5%—8%的速度递增^[1]，产肉量、产蛋量和产绒量均居世界第一，是中国畜牧业的重要组成部分及农民增收的重要经济来源之一。截止2014年，中国鸭、鹅存栏量分别为6.56亿只和 2.73亿只，分别占世界鸭、鹅总存栏量的58%和 83%，占中国家禽存栏量的12%和5%^[2]。 随着产业结构的调整，国内水禽业得到蓬勃发展，但同时由于集约化饲养、饲养水平参差不齐、管理经验缺乏和防疫技术滞后等原因，旧病如鸭瘟（鸭病毒性肠炎）、小鹅瘟和新发鸭坦布苏病毒病，鸭呼肠孤病毒病等疫病成为了制约产业健康发展的瓶颈。鸭瘟于1957年在中国首次报道^[3]，可感染鸭、鹅和其他雁形目禽类，主要造成水禽血管损伤、组织出血、消化道黏膜损伤、淋巴器官受损和实质性器官退行性病变，死亡率高，导致重大经济损失^[4]。小鹅瘟主要感染雏鹅和雏番鸭，被感染的水禽主要表现为精神委顿、食欲废绝、下痢，有时出现神经症状，发病率和死亡率可高达100%。常引起雏鹅大批死亡，对养鹅业的发展影响极大^[5]。鸭坦布苏病毒病于2010年首次在国内发现，造成产蛋鸭产蛋急剧下降，由于继发感染和饲养管理不当等因素可致死亡率达到15%—20%^[6-7]。呼肠孤病毒病多发生于幼龄水禽，以肝脏和脾脏等组织出现坏死性病变为特征。2005年以来，出现了新型鸭呼肠孤病毒，病变又发生了新的变化，肝脏出现不规则块/斑块坏死和出血灶^[8]。 为减少水禽疫病的危害，了解和掌握病原的生物学特性，快速和准确诊断，提供有效和经济的免疫接种用疫苗，科研人员在这些方面开展了大量的研究，并取得了一定的成果。本期（49卷14期）刊登的“水禽病研究专题”，收集有7篇论文，3篇与鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)相关，包括重组活载体疫苗的构建和胶体金快速诊断方法的建立；3篇与鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）相关，分别是鸭坦布苏病毒病卵巢病理变化规律的研究、灭活疫苗母源抗体消长规律的研究，以及1株鸡胚致弱疫苗株选育的研究；1篇是鸭呼肠孤病毒（duck reovirus，DRV）人工感染SPF鸡胚的病理学研究。虽然研究内容不尽相同，但最终目的都是为有效控制水禽传染病提供科学依据和理论基础，为通过疫苗免疫防控水禽疫病做好技术储备。 鸭瘟（鸭病毒性肠炎），是鸭、鹅、天鹅的一种急性、热性、败血性传染病，病死率高，对养鸭业危害严重。快速诊断是控制鸭瘟的有效措施之一，赵丹丹等^[9]研究制备的DPV-gB蛋白单克隆抗体特异、稳定，建立的DPV胶体金检测技术相比PCR、ELISA、间接免疫荧光技术、微量中和试验等检测鸭瘟的方法^[10]，具有速度快、无需特殊仪器设备、操作简单等优点，为基层临床检测提供了一种快速简便的方法。目前预防鸭瘟的主要措施为疫苗免疫接种。常用的疫苗有鸡胚化弱毒活疫苗和灭活疫苗，活载体疫苗因为具有活疫苗的免疫效力高、成本低及灭活疫苗的安全性好等优点，而备受关注。鸭瘟病毒作为疫苗活载体的研究取得了显著的进展^[11-14]。本专题中，孙莹等^[15]成功构建的表达绿色荧光蛋白重组鸭肠炎病毒，将GFP-gpt表达盒插入到UL2基因，通过重组病毒生物学特性的研究证明UL2基因缺失后不影响DEV的免疫原性，是一个比较稳定的外源基因插入位点，为DEV活载体疫苗研究奠定了基础。而陈柳等^[16]构建了表达鹅细小病毒VP2蛋白的重组鸭瘟病毒，重组病毒细胞生长特性与亲本毒株基本一致，且重组病毒在感染细胞中能表达外源蛋白VP2，接种雏番鸭能诱导VP2特异性抗体生成，为研制小鹅瘟-鸭瘟二联活载体疫苗奠定了基础。 鸭坦布苏病毒病自从2010年流行以来，已经成为中国养鸭业的主要疾病之一。国内多家单位和科研人员^[17-23]进行了DTMUV灭活疫苗、弱毒活疫苗和载体疫苗的研究，并取得了良好的进展。鸭坦布苏病毒病灭活疫苗（HB株）和活疫苗（WF100株）先后获得国家一类新兽药注册证书。本专题中于可响等^[24]通过鸡胚连续传代成功获得了1株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株，为鸭坦布苏病活疫苗的研发奠定了基础。但不论是灭活疫苗、活疫苗还是基因工程疫苗，都需要建立疫苗的效力检定方法，其对疫苗质量控制至关重要。林健等^[25]通过系统研究DTMUV人工感染产蛋鸭的卵巢病变产生时间、病变检查内容和判定标准，在利用卵巢病变评价疫苗的效力时，为确定疫苗效力检验何时检查卵巢病理变化和如何判定病变卵巢提供了科学依据。韩春华等^[26]通过鸭坦布苏病毒病灭活疫苗母源抗体效力和消长规律的研究，给出了合理的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的首免日龄。 关于在2003年开始流行于中国的鸭呼肠孤病毒，刘晓丽等^[27]利用分离的毒株建立了SPF鸡胚DRV感染模型，证明其能够在SPF鸡胚中复制增殖，并使雏鸡产生明显的病理变化，对鸡场DRV感染的防控提出了积极有效的意见。 水禽疫病的防控形势越来越严峻，过去认为水禽抵抗力强、疫病少的观点需要改变。在注重和加强生物安全措施的同时，免疫预防是防控疫病的重要措施，有效的疫苗是关键，但目前国内水禽专用疫苗种类有限。部分病原出现变异毒株或新的血清型，致病力改变，临床症状非典型化，原有疫苗的免疫保护效果不佳。还有一些新疫病尚无商品化疫苗可用。因此，加强水禽疫病诊断、防控技术研究和技术储备，特别是利用生物学技术开发的基因工程疫苗研究，可为有效控制水禽疫病提供科学合理的理论依据和切实可行的实施方案。     

鸭坦布苏病毒的流行现状和防疫用品的研究

正一、概述2011—2016年均发现了鸭坦布苏病毒在我国流行,是一种地方流行性疾病。在马来西亚报道过发病,泰国和越南等国也有发病。该病毒最早是1968年,Tembusu病毒首次在Sarawak地区的蚊子体内分离到;1982年和1992年在泰国北部地区蚊子体内分离到;1995年,我国研究人员从石家庄地区发病的康贝尔鸭肝和脾组织中分离到似乎属于黄病毒科的病毒。     

一株犬细小病毒的分离及VP2基因序列分析

采集病犬的粪便,经处理后接种狗肾传代细胞系（MDCK）,培养96h无任何细胞病变,盲传到第3代时细胞系出现明显的细胞脱落,核圆缩,形成CPE（cytopathic effect）。继续传代到第7代。第1、2代的细胞培养物不能凝集猪的红细胞,第3代以后的细胞培养物可以凝集猪的红细胞。采用PCR技术,在各代次的培养物中均能扩增得到特异性的DNA片断,经序列测定后鉴定为犬细小病毒,定名为BJY06。为进一步研究该分离株的遗传演化情况,扩增得到了VP2基因的全序列。经序列测定,用DANStar软件分析表明BJY06毒株为CPV-2a亚型,所得到的VP2基因全长1755bp,含有完整的阅读框架,编码584个氨基酸。与其它亚型的毒株相比较核苷酸的同源性为98.3%～99.6%。氨基酸同源性为97.1%～100%。     

鸡传染性喉气管炎的病理学研究

本研究对１４ 周龄的４２ 只 Ｓ Ｐ Ｆ鸡经气囊感染鸡喉气管炎病毒，通过病理组织学和扫描电镜检查，对不同感染阶段试验鸡进行研究。试验结果表明：感染后１２ｈ 气管粘膜淋巴细胞开始增生，以后逐渐增多，在８～９ ｄ 时逐渐减少，１２ ｄ 时基本降到原有水平；感染后２４ ｄ 气管粘膜上皮细胞开始形成合体细胞，３～４ ｄ 时普遍转变为合体细胞，并坏死脱落，６～７ ｄ 时出现再生，１２ ｄ 时基本恢复原有结构；腺体细胞在感染后坏死最早最严重，腺体细胞也是包涵体形成最早的细胞；在感染１２ ｄ时，气管粘膜上皮细胞纤毛项端开始融合并缩短，随后融合加剧，最终变成颗粒状或断裂脱落，上皮细胞表面裸露。除气管的病变外，肺脏发生支气管炎及出现核内包涵体，脾脏淋巴细胞，巨噬细胞增生及坏死，胸腺和法氏囊淋巴细胞增生及轻度坏死等变化。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。     

鸡传染性腺胃炎病原的分离鉴定

河北省某个体户蛋用种鸡场连续孵化出的７批海赛商品雏鸡共６万余只，在３０－８０日龄时发生一种以极度消瘦、腺胃肿大为特征的疾病。采集发病鸡的腺胃进行病原分离鉴定，从中分离出传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）。将发病鸡的腺胃匀乳剂及第５代鸡胚分离物接种ＳＰＦ鸡，结果用鸡腺胃匀尔剂接种的了与自然病鸡盯同的临床症状，而用第５代鸡胚分离物接种的鸡未能复制出胃肿大病例。取各接种绥鸡血清进行了１７种相关病原抗体检测，结     

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的诊断及其分子特点

采用流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、病毒分离、分离毒株测序以及遗传演化分析的方法,对北京及其周边地区4个猪场剖检的4头猪进行分析。结果:流行病学和临床症状表现为急性高热性传染病;病理学观察为非化脓性脑炎和间质性肺炎等多器官严重的病理变化;RT-PCR和病毒分离确定该疫情的主要病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。与典型PRRSV感染不同的是:成年猪感染率达50%以上,病死率达80%以上;PRRSV分离株全基因序列分析表明属于PRRSV北美洲型,特别是PRRSV NSP2不连续缺失30个氨基酸,说明此次流行的PRRSV毒株可能为高致病性毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组长约15kb，含有8个开放的阅读框架（ORFs）。PRRSV基因组的顺序依次为：5’-ORFla-ORFlb-ORF（2—6）．ORFT-3’。鲁韦韦等分析表明，PRRSV的ORF7基因保守性较好，变异较小。此外，ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白）具有良好的免疫原性及反应原性，机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的。因此，N蛋白常可作为诊断抗原来检测PRRSV。     

肉用仔鸡新城疫的诊断及免疫试验观察

20 0 1年 6～ 7月份 ,北京市延庆县某肉鸡场饲养的艾维茵商品代肉用仔鸡发生了一起以呼吸道症状、拉绿色稀便 ,后期出现神经症状为特征的疾病 ,鸡群死亡率高达 5 0 %以上。经临床及实验室诊断 ,此次发病是由ＮＤＶ强毒所致。采用现场分离的ＮＤＶ强毒株制成灭活疫苗 ,免疫肉仔鸡 ,免疫后鸡群无任何不良反应 ,整个饲养期生长正常。1　发病情况及临床症状该鸡场共饲养 92 0 0只艾维茵商品代肉仔鸡 ,分别放在 5栋鸡舍内。最北边两栋鸡舍先开始发病 (第四栋和第五栋 ,共 380 0只 )。从 2 1日龄起 ,这两栋鸡舍的部分鸡只出现呼吸道症状 ,拉绿色稀…