支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立和应用

根据支气管败血波氏杆菌ptxA基因设计1对引物,扩增特异的872 bp核酸片段,建立了应用PCR检测支气管败血波氏杆菌的方法.特异性试验结果表明,3株支气管败血波氏杆菌参考菌株均能扩增出872 bp特异性的核酸片段,兔源性的大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为210个支气管败血波氏杆菌.利用建立的PCR检测方法对22株从山东省泰安地区某兔场采集的疑似兔支气管败血波氏杆菌病病兔鼻黏液棉拭子进行检测,结果19株为阳性.并同时进行普通血清学方法和细菌学方法,对检测结果进行了比较,结果显示,PCR方法阳性检出率高于其他检测方法.     

兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立同时检测兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的双重PCR检测方法,本研究根据金黄色葡萄球菌的nuc基因和支气管败血波氏杆菌的fimN基因的保守序列设计2对特异性引物,通过优化反应条件,成功建立兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法。该方法对兔多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和魏氏梭菌的检测结果为阴性;能够检出5pg的金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的基因组DNA;与单重PCR检测方法的符合率为100%。说明本试验建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和准确性,为兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的鉴别诊断提供了有效的技术手段。     

兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌复合PCR方法的建立及临床应用

根据Gen Bank中多杀性巴氏杆菌ATP合成酶基因(atp B)的保守序列设计特异性引物,建立巴氏杆菌PCR检测方法,并与已建立的支气管败血波氏杆菌PCR检测方法进行合并,经反应条件的优化,成功建立多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌复合PCR诊断方法。该方法检出的最小多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌菌数分别为40 CFU和4 CFU;对兔源产气荚膜梭菌、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪鼻支原体、链球菌的检测结果均为阴性,说明该方法具有良好的特异性。用该方法对中国4个省份采集的临床鼻拭子样本共712份进行检测,结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为25.56%,支气管败血波氏杆菌阳性率为34.55%,双阳性率为13.20%。该复合PCR方法能快速、敏感地从家兔鼻拭子样品中检出多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌,为临床疾病检测和流行病学调查提供了技术保障。     

胸膜肺炎放线杆菌的PCR诊断方法研究

采用胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)外膜脂蛋白Om/A基因序列合成了1对特异性引物,建立了用于检测App的PCR方法.结果表明:经过PCR扩增,3株App分离株均能扩增出长约950 bp的预期DNA片段,而大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、变形杆菌(Proteus sp.)和链球菌(Streptococcus sp.)等与猪病有关的8种病原菌均为阴性;App DNA最低检出浓度可达55.0 ng/mL,且试验结果与传统的生化反应鉴定结果完全一致,符合率达100%,证明此方法特异性和敏感性强,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断.     

兔支气管败血波氏杆菌病的防治

兔支气管败血波氏杆菌病是由兔支气管败血波氏杆菌引起的一种家兔常见传染病。临床上以出现呼吸道症状为主的病理特征。本病传播广泛,常呈地方性流行或散发性,一般毛兔的发病率较高,为条件性致病,多在气候多变、阴雨潮湿以及其他应激因素等条件下,因机体抵抗力下降而发病,常与兔多杀性巴氏杆菌混合感染。兔支气管败血波氏杆菌病根据发病症状可将其分为败血型、鼻炎型和支气管肺     

兔源F型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

【目的】建立检测兔源F型多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,为兔巴氏杆菌病的诊断提供技术支持。【方法】根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因的保守序列分别设计了2对引物进行双重PCR扩增,对双重PCR检测方法的退火温度和混合引物浓度进行优化,并对方法的特异性、敏感性、重复性和准确性进行验证。【结果】该双重PCR方法最优反应条件为:退火温度60℃、混合引物浓度0.8μmol·L~(-1)。该双重PCR方法能扩增出兔源F型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp)和fcbD基因片段(490 bp)、兔源A和D型多杀性巴氏杆菌的kmt1基因片段(260 bp),对兔源支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照均为阴性,无交叉反应,特异性较强。该方法对兔源F型多杀性巴氏杆菌的最低检出限为1×10~3拷贝·μL~(-1),敏感性高。应用该方法对90份病死兔肺脏样品进行批内和批间重复性试验,结果均一致,重复性好。应用该双重PCR方法和已报道的多重PCR方法同时检测87份已知结果的呼吸道病死兔肺脏样品,结果显示双重PCR方法检测结果和已报道的多重PCR方法检测结果与已知结果的符合率分别为97.70%和94.25%,双重PCR方法检测结果与已报道的多重PCR方法检测结果的符合率为93.10%,双重PCR方法的准确性更高。【结论】针对多杀性巴氏杆菌kmt1基因和F型多杀性巴氏杆菌fcbD基因建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性,为兔源F型多杀性巴氏杆菌的快速检测提供了技术支撑。     

兔支气管败血波氏杆菌双夹心ELISA检测方法的建立

为建立特异性好、敏感性高、稳定可靠的兔支气管败血波氏杆菌(Bb)双夹心ELISA检测方法,制备了兔抗Bb免疫血清和小鼠抗Bb腹水单抗(Bb McAb),并将它们提纯。用方阵法筛选最佳反应浓度,用特异性试验、敏感性试验和重复性试验对该方法进行鉴定,并与PCR检测方法比较。结果表明,兔抗Bb IgG的最佳稀释度为1∶6 400,浓度为2.5 mg/L;单抗的最佳稀释度为1∶800,浓度为5.0 mg/L。特异性试验和重复性试验结果表明,该方法特异性强、重复性好,与兔常见病菌大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌和产气荚膜梭菌均不发生反应,同时与PCR检测方法的符合率为100%。     

兔支气管败血波氏杆菌OMP-ELISA抗体检测方法的建立

为简便快速检测支气管败血波氏杆菌(Bb),建立了一种特异、敏感的间接ELISA方法。通过应用超声波裂解和超速离心法提取了支气管败血波氏杆菌Ⅰ相菌外膜蛋白(OMPs),并用该蛋白包被酶标板,经特异性、敏感性和重复性试验优化后建立间接ELISA方法。结果表明,试验确定抗原的包被浓度为14.44μg/ml,可检测血清最高稀释度达1：400;该方法有很高的特异性和敏感性,与微量凝集试验相比,敏感性提高约33倍;该方法重复性良好。     

养兔谨防波氏杆菌病

兔波氏杆菌病也叫兔支气管败血波氏杆菌病,是由支气管败血波氏杆菌引起兔的一种常见的呼吸道传染病,特征表现慢性鼻炎、支气管肺炎和咽炎。在冬季和早春多发。主要通过空气传播,经呼吸道感染。幼兔发病率高,并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在笼养兔污染为64.4%,散养兔为20.0%。在自然条件     

兔支气管败血波氏杆菌不同感染途径研究

用兔支气管败血波氏杆菌分离株BJL0504菌株(I相菌)经滴鼻、肺内、气管、静脉、皮下对30～40日龄兔攻毒,并进行临床观察和微生物学检查,比较不同攻毒方法的优势。结果显示,经静脉注射的家兔发病率和死亡率高,症状较典型;经肺内注射也可以引起部分发病和死亡;滴鼻和气管注射感染均可以复制到典型的临床症状,但是解剖病变都不明显。由此可见,支气管败血波氏杆菌经静脉攻毒可以较好的复制病例,这对支气管败血波氏杆菌的致病机理的研究、疫苗的研制和评价提供了理论基础。     

采用环介导等温扩增技术快速检测猪丹毒丝菌病原体

[目的]建立猪丹毒丝菌(E.rhusiopathiae)毒力株的快速检测方法.[方法]利用快速灵敏的环介导等温扩增技术( Loop - mediated Isotherml amplification,LAMP)针对丹毒丝菌spa基因较为保守区域设计4条特异性LAMP引物,采用FTA(Flinders technology associates,FTA)滤膜法提取12种血清型丹毒丝菌,8种非丹毒丝菌及受感染小鼠血液的基因组DNA,分析LAMP环引物的特异性;比较LAMP与传统PCR方法的扩增敏感性和产物特异性.[结果]在61℃恒温条件下,LAMP法能够特异性扩增丹毒丝菌特异条带,与常规PCR扩增结果一致;灵敏度实验表明LAMP法检测猪丹毒丝菌的检测下限为2 CFU/mL,较传统PCR的敏感性(大于20 CFU/mL)至少高10倍.LAMP方法与PCR方法都能在小鼠感染模型血样中检测到浓度为200CFU(10-7)/mL以上浓度的丹毒丝菌.[结论]LAMP法与FTA滤膜法相结合在检测丹毒丝菌中具有潜在的应用价值.     

微卫星分子标记鉴别羊肉真伪方法的建立及应用

根据动物种间特异性的原则,筛选出1对微卫星引物,建立了一种鉴别羊肉真伪的PCR检测技术。应用该方法,检测不同品种的羊肉样本(山羊、绵羊、杂交羊等)均能特异扩增出220~247 bp的目的片段,而猪、牛、鸡、鸭、兔等动物样本均呈阴性。该方法对羊肉的检测敏感度达10-10。应用该方法对山东省内屠宰场生产线、超市、市场中的各种畜禽鲜肉样品进行鉴定,羊肉的检出率为100%。     

转基因大豆OsDREB3品系特异性定性PCR检测方法的建立

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。     

鹅源性成分PCR检测方法的建立

[目的]建立一种检测鹅源性成分的PCR方法。[方法]以15种动物的DNA为模板,利用鹅的特异性引物进行PCR反应,PCR产物用1．4％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序,检测引物的特异性和敏感性。[结果]通过PCR反应从鹅样品中扩增到了304bp的目的片段,其他物种火鸡、鸭、鸽鹑、鸵鸟、鸽子、鸡、马、牛、羊、猪、狗、驴、猫、鱼和空白对照则无目的片段,表明该引物的特异性良好。鹅组织PCR产物的核苷酸序列与GenBank中检索到的相应序列基本符合,相似性为98％;PCR检测方法的检测灵敏度为0．01％。[结论]该PCR检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高、可重复性好,为明确食品与饲料的成分和来源,预防禽流感的传播提供了有效的分子生物学捡测方法.     

肉品中两种致病菌的双重PCR快速检测技术的研究

[目的]建立一种同步检测肉品中金黄色葡萄球菌与沙门氏菌的双重聚合酶链式反应.[方法]采用7.5;氯化钠肉汤和GN增菌剂分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行增菌,根据金黄色葡萄球菌的femA基因与沙门氏菌的invA基因设计引物,通过PCR反应对目标基因进行扩增,并对反应体系进行优化.[结果]特异性实验显示引物特异性良好,经双重体外扩增体系优化显示条带清晰,无非特异性的扩增条带.[结论]双重PCR是一种灵敏度高的快捷检测方法,可为这两种致病菌的同时检出提供新途径.     

锦鲤疱疹病毒潜伏感染实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种特异和敏感的检测锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus,KHV)潜伏感染的方法,以KHV Sph基因为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立Real–Time PCR检测方法,并且对该方法进行特异性和敏感性评估及临床样品应用研究。结果显示:建立的方法与鲤痘疱疹病毒、金鱼造血器官坏死病病毒和鳗鲡疱疹病毒均无交叉反应,特异性强;最低检出率为42拷贝/μL,灵敏度高。用本方法对63份临床样品进行检测,有锦鲤疱疹病毒病(KHVD)病史的18份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;从有临床症状的鱼中得到的15份样品的检测结果全为阳性,阳性率为100%;30份无任何临床症状鱼中的6份被检测为阳性,阳性率为20%。本试验中建立的水生动物疱疹病毒潜伏感染快速检测方法,可为潜伏感染KHV的临床检测提供一种快速、敏感和特异的检测手段,可为KHVD的分子流行病学调查和预防提供参考。     

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用

根据GenBank中猪肺炎支原体（Mhp）J株P36蛋白基因（登录号X67286）的核苷酸序列设计1对引物,建立了快速检测Mhp的PCR方法。该方法能扩增出948bp的Mhp特异性条带,其敏感性达到可检测出0．735ng的MhpDNA,但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带;将克隆获得的目的片段与GenBank已发表的MhpJ株的P36基因进行比较,同源性达到99．9％。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎（MPS）病料进行临床诊断,发现有13份呈阳性（31．0％）。可见,该PCR方法适合于MPS的临床诊断,可为其防控提供可靠依据。     

基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中鸭疫里默氏杆菌(RA)16SrRNA基因序列设计特异性引物,建立了基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法。以建立的PCR方法对RA、大肠杆菌、沙门氏菌、鸭源金黄色葡萄球菌、两双歧杆菌、短乳酸杆菌、屎肠球菌和短小芽孢杆菌进行检测,结果只有RA DNA能扩增出844 bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;从凝胶中回收DNA条带,测序结果与GenBank中RA相应序列完全一致。对不同稀释度的RADNA样品进行扩增,PCR对RA DNA最小检出量为22 pg,最少检出RA 80 CFU/mL。以该PCR方法对可疑为RA的临床病料和菌株进行检测和鉴定,结果与细菌分离鉴定吻合率为100%。表明本研究所建立的基于RA 16SrRNAPCR方法具有快速、灵敏、特异的优点,可用于RA感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定。     

喀斯特炭疽菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立

为寻求喀斯特炭疽菌的快速检测方法,利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,以喀斯特炭疽菌基因组中的ACT基因为靶序列设计并筛选特异性引物探针,通过特异性、灵敏度、重复性试验建立喀斯特炭疽菌TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。结果表明:建立方法的特异性较强、灵敏度较高、重复性稳定性较好,最低检测限为0.2pg DNA/反应,标准曲线的线性关系良好,相关系数为0.998。该方法操作简便,可用于进出境口岸喀斯特炭疽菌的检疫。