保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶的原核表达和鉴定

为研究保加利亚乳杆菌(LB)N-乙酰胞壁质酶(Mur)的分子生物学特性,根据已发表的保加利亚乳杆菌核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,PCR扩增LB MN株不含跨膜区域序列的mur基因,片段回收后克隆至pMD19-T载体并进行鉴定,再将其亚克隆于原核表达载体pET-30a(+)中构建重组表达质粒pET-30a(+)-mur,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示重组Mur蛋白分子量约为21 kD,能在大肠杆菌中高效表达。     

建立密植高产桑园的桑压条苗甲醛处理法

为了改造低产桑园、建立密植高产桑园,研究建立了提高压条苗生产效率的压条苗甲醛处理法,研究结果表明压条苗甲醛处理的生根数比环割处理增加130%,比非环割增加190%;压条苗甲醛处理的新根的生长比环割处理高1.5倍,比非环割处理高1.3倍;成苗率也是压条苗甲醛处理最好。该方法是一种高效成苗的方法。     

应用PCR-DGGE分析发酵床养殖仔猪消化道菌群多样性及其演替

利用PCR-DGGE技术研究了发酵床和水泥地养殖21d和42d仔猪消化道各段菌群多样性和相似性,结果表明,饲养全程中仔猪胃中菌群种类较少,经胃酸等抑制作用,回肠中菌群最少;之后,菌群迅速增殖,盲肠、结肠中菌群种类较多。相比于水泥地,发酵床提供了稳定而丰富的菌群和稳定的温湿度,能够持续增加消化道两端的胃和结肠中的菌群多样性,促进回肠菌群演替为稳定的盲肠菌群;全程保持较高比例的乳酸菌属,一定程度上抑制或减缓弯曲菌属、志贺菌属、埃希氏菌属生长增殖,有利于构建和维护仔猪消化道正常菌群,对于提高仔猪健康和生产性能是一种较为理想的养殖方式。     

仔猪多发性关节炎病原菌的分离鉴定及耐药性研究

从山东地区32个猪场发生多发性关节炎的仔猪体内分离到15株病原菌。通过对分离菌株的形态染色、分离培养、生化试验及种特异性基因的PCR扩增等方法鉴定菌株,结果显示4株分离菌株为副猪嗜血杆菌,7株为猪链球菌,2株为化脓隐秘杆菌,1株为猪胸膜肺炎放线杆菌,1株为猪丹毒杆菌。15株分离菌均对昆明小鼠有较强的致病力,且对先锋霉素类抗生素高度敏感,大多数菌株还对青霉素类、头孢菌素Ⅲ类、氟喹诺酮类、万古霉素、壮观霉素等抗生素高度敏感。该试验表明山东地区猪场仔猪多发性关节炎的病原菌主要是副猪嗜血杆菌和猪链球菌,可交替使用上述敏感抗生素防治该病。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒WF-1株的分离鉴定及NSP2和ORF5基因的变异分析

从山东某大型猪场患"猪高热病"的病料中分离到1株病毒,该病毒可在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变。经RT-PCR鉴定证明,该病毒为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将其命名为WF-1株。用RT-PCR法分别扩增该分离株的NSP2基因和ORF5基因,并进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,PRRSV WF-1株的NSP2发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与PRRSV参考变异株JXA1相同;ORF5基因与JXA1、CH-1a、VR2332核苷酸同源性分别为98.0%、94.2%、86.4%,氨基酸同源性分别为97.5%、94.0%、87.5%。基因遗传进化树分析结果显示,WF-1株与2006～2008年期间分离的JXA1、SX-1等高致病性变异株的亲缘关系很近,与1996年分离的中等毒力毒株CH-1a亲缘关系较远,与VR2332、CC-1、MLV等弱毒株或疫苗株处于不同的分支。     

猪链球菌2型分离鉴定及其对小鼠的致病性分析

为了解猪链球菌2型菌株对昆明小鼠的致病性,并建立其感染昆明小鼠模型,本试验分别取2头疑似患链球菌病的病死猪脑组织、血液分别涂布于含5%胎牛血清的TSA固体培养基中进行细菌分离;并对分离获得的细菌进行形态观察、PCR鉴定、药物敏感性试验、小鼠致病性试验及组织病理切片观察。结果显示,分离菌为革兰氏阳性短链球菌,经PCR鉴定为猪链球菌2型,命名为LY株;药敏试验证实LY株对青霉素、红霉素、氯霉素、苯唑西林、环丙沙星、诺氟沙星敏感,对四环素、多粘菌素B、克林霉素不敏感;LY株对小鼠致死剂量为2.2×10⁹ cfu/只;组织病理切片观察发现小鼠肺脏、脾脏及心肌均出现不同程度的病变。本研究明确了山东省猪链球2型毒株的毒力,为疫苗候选菌株的筛选提供了理论依据。     

微卫星分子标记鉴别羊肉真伪方法的建立及应用

根据动物种间特异性的原则,筛选出1对微卫星引物,建立了一种鉴别羊肉真伪的PCR检测技术。应用该方法,检测不同品种的羊肉样本(山羊、绵羊、杂交羊等)均能特异扩增出220~247 bp的目的片段,而猪、牛、鸡、鸭、兔等动物样本均呈阴性。该方法对羊肉的检测敏感度达10-10。应用该方法对山东省内屠宰场生产线、超市、市场中的各种畜禽鲜肉样品进行鉴定,羊肉的检出率为100%。     

保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为了研究保加利亚乳杆菌N-乙酰胞壁质酶基因的结构特征及编码蛋白的功能,根据GenBank中其基因的DNA序列设计引物,以保加利亚乳杆菌MN株的基因组为DNA模板,利用PCR技术扩增N-乙酰胞壁质酶基因,将其克隆到pMD-19T载体上,进行测序与生物信息学分析。结果表明,MN株N-乙酰胞壁质酶基因序列编码217个氨基酸,与GenBank中公开的N-乙酰胞壁质酶基因核苷酸序列的同源性为98.8%～100.0%;蛋白质的理论分子质量为24.55 ku,理论等电点为9.83;该蛋白属于亲水性蛋白,二级结构以α-螺旋为主;该蛋白的第16～38位氨基酸残基组成跨膜区,第56～216位氨基酸残基组成LYZ2结构域。研究结果为今后探讨N-乙酰胞壁质酶基因的生物学功能及其功能改造奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒JX16株的分离鉴定及体外传代对其毒力的影响

2010年中国新出现了以新生仔猪高发病率、高死亡率为主要特征的变异株。为了明确山东地区猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）变异株特征，本试验利用Vero细胞对莒县某猪场的腹泻病料进行了病毒分离和体外传代培养。通过光学显微镜和细胞超薄切片观察、RT-PCR检测、间接免疫荧光试验、S基因序列进化分析、滴度测定和致病力试验进行病毒序列及特征分析，并探究接毒后细胞脱落时间的变化。光学显微镜观察发现，该病毒感染Vero细胞后能引起典型的合胞体病变；细胞超薄切片观察发现，病毒粒子多呈致密核芯，能引起宿主细胞线粒体肿胀，溶解；RT-PCR检测和间接免疫荧光试验结果证实其为PEDV，最终通过测序证实该毒株为变异毒株。体外传代培养至100代过程中，随着病毒代次升高，其对细胞适应性不断增强。接毒后细胞脱落时间由48 h逐渐缩短至17 h，病毒滴度由6代时的10^5.3TCID₅₀/mL逐渐升高至100代的10^7.5TCID₅₀/mL。致病力试验结果显示，病毒毒力随代次升高逐渐下降，40代时对仔猪已无致病力。本试验结果为PEDV突变株致病基因的确定及疫苗的研发奠定了基础。     

兰考泡桐花的挥发性成分分析研究

采用同时蒸馏萃取(SDE)和顶空固相微萃取(HS-SPME)法,结合气质联用仪(GC-MS),分析了兰考泡桐花的挥发性香成分,共鉴定出67种挥发性化合物:其中酯10种、醛9种、酮4种、酚2种、烃36种、醇5种、酰胺化合物1种。3种方法鉴定出的共有组分主要有1-辛烯-3-醇、1,4二-甲氧基苯、(Z)-3,7二-甲基-1,3,7-辛三烯、苯甲酸甲酯、2-羟基苯甲酸甲酯、1-甲氧基-4-(1-丙烯基)苯等10种。