HLA-A胞外区成熟肽基因的克隆及其原核表达载体的构建

根据GenBank基因库中HLA-A胞外区成熟肽基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从健康人血液中扩增HLA-A胞外区基因,扩增产物进行T-A克隆、测序.结果表明,获得的HLA-A胞外区基因大小为819 bp,与模板序列的同源性为96%.利用基因重组技术,将HLA-A胞外区基因亚克隆入pET-21a(+) 载体中.经PCR、酶切和测序鉴定,证实所获重组表达质粒pET-21/ HLA-A中含有目的片段,且连接、构建正确,表明成功构建了重组表达质粒pET-21/ HLA-A.     

鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因的克隆、序列分析及表达载体构建

【目的】克隆鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pET/DuMHC-Ⅰ。【方法】依据GenBank/DDBJ/EMBL基因库中公布的鸭MHC-Ⅰ基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中扩增MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA,T-A克隆到pGEM-T Easy载体中,并进行测序。通过PCR和酶切的方法,将鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因亚克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ,并进行PCR、NcoⅠ和NotⅠ双酶切及测序鉴定。【结果】测序结果表明,获得了MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,其长度为813 bp,编码271个氨基酸。MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因与GenBank中登录的鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因序列的同源性为89.4%~91.7%,氨基酸同源性为78.2%~83.7%;与鸡、鹅、鹌鹑、草鱼、狗、猪、鼠和人的MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽氨基酸序列的同源性分别为64.6%,79.3%,59.4%,41.0%,26.6%,45.0%,12.5%和22.1%,这表明MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因存在着种属多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。所获重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ经PCR、酶切、测序鉴定,证实鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA已正确克隆入pET-28a(+)表达载体。【结论】成功克隆出鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,并构建了重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的克隆与原核表达

为在原核表达系统中表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,提取感染PCV2的细胞基因组DNA,PCR扩增ORF2基因片段并克隆至pMD-18T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定后,将该基因重组至pET-28a原核表达载体,构建了表达载体pET-28a-ORF2。该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1mmol/LIPTG于37℃诱导5h得到最佳表达。表达重组蛋白的分子量为26.0kD,以包涵体形式存在。Western-Blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达

【目的】构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2原核表达质粒载体,高效重组表达PCV2壳蛋白Cap,为进一步建立PCV2 ELISA的检测方法及Cap蛋白单克隆抗体的制备研究奠定基础。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计带有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的引物,进行ORF2的PCR体外扩增。用扩增的ORF2基因构建pMD18-T-ORF2质粒,经测序检测正确后,与pET-32a(+)连接获得原核表达重组质粒pET-32a-ORF2。重组质粒pET-32a-ORF2转化BL21-ΔE3后用IPTG诱导表达,对获得的纯化表达产物进行了SDS-PAGE电泳、Western blot检测。【结果】PCR扩增得到了预期580 bp的目的基因,连接载体后经测序完全正确;pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3得到高效表达,获得以包涵体形式存在的体外重组原核表达PCV2 Cap蛋白;Western blot检测结果表明,所得到的蛋白能够识别PCV2多克隆抗体。【结论】重组质粒pET-32a-ORF2在BL21-ΔE3高效表达重组PCV2 Cap蛋白,且具有免疫学生物活性。     

水貂阿留申病毒部分VP2基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析

根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列设计合成1对特异引物,利用PCR方法扩增ADV国内分离株部分VP2基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-28a中.经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,构建了原核表达载体pET-28a-VP2.阳性重组质粒转化宿主菌BL21,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明蛋白获得了表达,表达产物的分子质量为21 kD,与理论推测的分子质量一致;在终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导下,5 h时表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗水貂抗体所识别,具有相应的抗原性.     

小鼠β-酪蛋白基因载体的构建与表达

通过RT-PCR方法扩增β-酪蛋白基因,扩增产物插入质粒载体pET-28a中构建成表达载体,转化入大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导表达.利用限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列测定及SDS-PAGE,结果表明,成功地用RT-PCR方法从小鼠乳腺组织中克隆出β-CN基因并构建了重组β-CN的表达载体,并在大肠杆菌获得表达.     

藏猪β-防御素2基因克隆及原核表达载体的构建

为了构建藏猪β-防御素2(pBD-2)成熟肽原核表达载体,从藏猪肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR获取pBD-2目的基因,并与pMD19-T载体连接构建重组质粒,命名为pMD19T-pBD-2;以pMD19T-pBD-2质粒为模板,克隆pBD-2成熟肽c DNA序列并构建成熟肽p ET-32a-pBD-2表达质粒。结果显示,藏猪pBD-2基因全长为298bp,与野猪和家猪的pBD-2基因同源性分别达100.0%和98.9%;藏猪pBD-2基因具有1个完整的开放阅读框,编码69个氨基酸组成的多肽,包含21个氨基酸残基的信号肽、11个氨基酸残基的前导肽和37个氨基酸残基的成熟肽;编码的pBD-2成熟肽稳定性较好,分子量4 085.78,等电点8.89,具有6个半胱氨酸(Cys)残基,7个带正电荷和2个带负电荷的氨基酸残基,为亲脂性和亲水性多肽;从pMD19T-pBD-2质粒中亚克隆得到长度为114 bp藏猪pBD-2成熟肽c DNA序列,菌落PCR、酶切和测序鉴定证明成功构建了成熟肽pET-32a-pBD-2原核表达质粒。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因克隆及在不同原核表达系统中的表达

RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T pIL18,转化E.coli JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将其分别克隆到表达载体pQE30、pET-28a、pGEX6P-1中,构建重组表达质粒pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18.用IPTG诱导表达,重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量分别为19 000、21 000、45 000的重组蛋白.经薄层扫描分析,pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18菌体裂解物分别占菌体总蛋白的17%、28%、27%,均以包涵体形式存在.     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。     

肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达

[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达。[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a（＋）上构建表达载体,重组质粒转化E.coil BL21（DE3）进行蛋白质表达。[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a（＋）载体上,重组质粒转入E.coil BL21（DE3）后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白。[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础。     

假肠膜明串珠菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆与表达

利用PCR的方法从假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides 1159)的DNA中扩增得到D-乳酸脱氢酶基因,构建重组克隆质粒(pMD19-T-DLDH),转化DH5α进行蓝白斑筛选,得到阳性克隆提取质粒双酶切验证。连接pET-32a表达质粒,构建重组表达质粒,提取质粒双酶切、测序验证,测序结果与原序列基本相符。得到重组表达质粒pET-32-DLDH转化BL21大肠杆菌IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示有明显大小约为19 ku的特异蛋白条带。     

猪γ干扰素的表达及抗病毒活性研究

利用RT-PCR技术从有丝分裂原刀豆素(ConA)诱导的长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增出猪γ干扰素的成熟肽基因(mPolFN-γ),并将其亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-mPoIFN-γ.经PCR、酶切及测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAG...     

布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275基因的原核表达与鉴定

【目的】克隆布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275的基因并进行诱导表达。【方法】从牛种布鲁氏菌2308株基因组中PCR扩增BPE123和BPE275基因片段,亚克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。将BPE123和BPE275基因克隆至融合表达载体pET-28a,构建表达重组质粒pET-28a-BPE123和pET-28aBPE275,在大肠杆菌中进行诱导表达,Western blot分析重组蛋白His-BPE123和His-BPE275的免疫学特性。【结果】PCR扩增获得了462bp的BPE123基因片段和762bp的BPE275基因片段,成功构建了pET-28a-BPE123、pET-28a-BPE275原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BPE123和BPE275蛋白,经SDS-PAGE检测,重组融合蛋白BPE123、BPE275的分子质量分别约为22和31ku,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别表达的蛋白。【结论】克隆了分泌蛋白BPE123、BPE275基因片段,并成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275。     

牦牛β-防御素5基因的原核表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆与表达牦牛β-防御素5(BNBD5)基因,检测其重组蛋白的体外抗菌活性。【方法】采用RT-PCR方法从牦牛肺组织中扩增BNBD5基因成熟肽编码区,根据已发现的哺乳动物β-防御素5和部分禽β-防御素5的序列构建遗传进化树。将BNBD5基因亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pET32a-BNBD5。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG于37℃进行诱导表达,SDSPAGE检测融合蛋白的表达情况,并对该重组蛋白进行纯化,测定其体外抑菌活性。【结果】克隆得到了BNBD5基因成熟肽编码片段,其长度为138bp,编码45个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因序列与黄牛的mRNA同源性最高,可达到86.2%。经IPTG诱导,获得了分子质量为25ku的牦牛β防御素-5成熟肽融合蛋白。琼脂糖扩散结果表明,0.08mg/mL的纯化蛋白对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有抗菌作用。【结论】牦牛BNBD5成熟肽在大肠杆菌中得到了成功表达,其产物对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抗性。     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

新疆加工番茄上南方番茄病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

【目的】克隆南方番茄病毒(STV)的外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体并进行诱导表达,为制备检测该病毒的高效价血清提供参考。【方法】利用一步法RT-PCR从新疆加工番茄上克隆STVCP基因,将其连接到原核表达载体pET-28a(+)上,获得重组质粒pET-28a-STV CP。将重组质粒转化大肠杆菌BL21后用IPTG进行诱导表达。【结果】成功克隆了STVCP基因,其长度为1 134bp。构建了原核重组表达质粒pET-28a-STV CP,其在1mmol/L IPTG诱导下,成功表达出分子质量约47ku的蛋白。【结论】成功克隆了STV CP基因,并诱导了pET-28a-STV CP重组蛋白的原核表达。     

Prokaryotic Expression of Listeriolysin O (LLO) Gene in Escherichia coil and Analysis of Soluble LLO Protein

对单核增生性李氏杆菌的主要毒力基因hlyA进行大肠杆菌原核表达,分析其表达蛋白的可溶性并纯化.根据hlyA基因设计特异性引物,细菌煮沸破裂提取基因组,PCR扩增出目的条带.连接转化至克隆载体pMD18-T,测序正确后连接表达载体pET-30a(+),酶切和PCR鉴定正确后转化至BL21 (DE3),构建重组质粒pET-30a-hlyA.IPTG诱导表达蛋白,并分析其可溶性.PCR扩增的hlyA基因全长约1600 bp,成功构建了重组质粒pET-30a-hlyA,转化大肠杆菌诱导表达了溶血素蛋白,SDS- PAGE分析表达产物,结果显示表达的蛋白分子量约为60kD,以可溶性和包涵体2种形式存在,且以可溶性为主要形式.成功克隆和表达了单核细胞增生性李氏杆菌hlyA基因和溶血素蛋白,并得到纯化蛋白.     

人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆含人gp130和IL-12Rβ2胞外段的基因并构建人gp 130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因真核表达载体.方法 设计合成特异性引物,以人外周血单个核细胞(PBMC)cDNA为模板,PCR法扩增gp130胞外段基因和IL-12Rβ2胞外段基因;应用T-A克隆技术和亚克隆技术,构建骨架为GV140的人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因真核表达载体.结果 PCR扩增得到人gp130胞外段基因,IL-12Rβ2胞外段基因和gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因片段,克隆得到重组体GV 140-gp 130-IL-12Rβ2,测序验证了重组体的准确性.结论 成功构建了人gp130-IL-12Rβ2胞外段融合蛋白基因真核表达载体.     

黑曲霉植酸酶基因phyA的克隆及在大肠杆菌中的表达

为获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生物生物制剂,从自行筛选的黑曲霉中提取RNA.通过反转录合成模板cDNA,根据pyhA成熟肽编码序列设计出一对引物,PCR扩增phrA,对扩增片段进行了克隆,通过限制性内切酶酶切分析、DNA测序证明phyA基因克隆成功.从pBS-T-phyA克隆中获取phya编码序列,将其与pET28a+质粒连接,构建pET28a+-phyA重组质粒,并在大肠杆菌中获得高效表达.本研究成功克隆phyA,该基因全长1404bp,以ATG为起始密码子,TGA为终止密码子,编码467个氨基酸组成的多肽.SDS-PAGE电泳结果表明,phyA在大肠杆菌中成功表达,成熟植酸酶的分子量约为51kDa.在0.4g·L-1的IPTG的诱导下,植酸酶活性最大(1174U).