鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因的克隆、序列分析及表达载体构建

【目的】克隆鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA序列,构建并鉴定其原核表达质粒pET/DuMHC-Ⅰ。【方法】依据GenBank/DDBJ/EMBL基因库中公布的鸭MHC-Ⅰ基因序列设计1对引物,采用RT-PCR技术从鸳鸯鸭脾脏组织中扩增MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA,T-A克隆到pGEM-T Easy载体中,并进行测序。通过PCR和酶切的方法,将鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因亚克隆入pET-28a(+)载体,构建重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ,并进行PCR、NcoⅠ和NotⅠ双酶切及测序鉴定。【结果】测序结果表明,获得了MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,其长度为813 bp,编码271个氨基酸。MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因与GenBank中登录的鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因序列的同源性为89.4%~91.7%,氨基酸同源性为78.2%~83.7%;与鸡、鹅、鹌鹑、草鱼、狗、猪、鼠和人的MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽氨基酸序列的同源性分别为64.6%,79.3%,59.4%,41.0%,26.6%,45.0%,12.5%和22.1%,这表明MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因存在着种属多样性,且亲缘关系越近,同源性越高。所获重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ经PCR、酶切、测序鉴定,证实鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因cDNA已正确克隆入pET-28a(+)表达载体。【结论】成功克隆出鸭MHC-Ⅰα链胞外区成熟肽基因,并构建了重组表达质粒pET/Du MHC-Ⅰ。