仔猪大肠埃希氏菌、C型产气荚膜梭菌的灭活及脱毒方法研究

[目的]研究仔猪大肠埃希氏菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的质量及产品的安全性。[方法]对大肠埃希氏菌和C型产气荚膜梭菌浓缩菌液,用不同浓度甲醛溶液经不同灭活时间、灭活温度进行了灭活和脱毒试验。[结果]大肠埃希氏菌培养物在37～38℃条件下用0.4%的甲醛溶液灭活48h,可以使细菌全部灭活;C型产气荚膜梭菌培养物在37～38℃,采用0.5%～0.8%的甲醛溶液进行灭活和脱毒7～14d,或者采用2次灭活和脱毒方法,7d可以达到完全灭活和脱毒。[结论]在37～38℃条件下,用0.4%的甲醛溶液对大肠埃希氏菌培养物灭活和采用0.5%～0.8%的甲醛溶液对C型产气荚膜梭菌进行灭活和脱毒,可以达到理想效果。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因的原核表达

大肠杆菌(Escherichia coli)不耐热肠毒素B亚单位(LTB)不仅是重要的黏膜免疫原,而且作为佐剂在黏膜免疫中起着重要的作用.试验采用PCR方法扩增了肠毒素性大肠杆菌的LTB基因,并将其克隆到pGEX-KG原核表达栽体上,构建了重组质粒pKG-LTB,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的LTB基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-LTB分子量约为35kDa,并具有免疫反应活性.这为进一步研究LTB蛋白黏膜免疫原性和黏膜佐剂的作用奠定了基础.     

高致病性猪蓝耳病病毒湖北分离株细胞培养特性研究

高致病性猪蓝耳病是近年来严重危害我国养猪业的一种传染病。为了探明高致病性猪蓝耳病病毒在Marc145细胞上的增殖特性,本研究在分离获得高致病性猪蓝耳病病毒湖北株的基础上进行了细胞培养特性研究。结果表明:高致病性猪蓝耳病病毒湖北株在Marc145细胞上增殖所需的最佳条件分别为:营养液最佳血清含量为10%;最佳pH值为7.2~7.4;细胞最佳培养密度为105~2×105/mL;病毒增殖的最佳接毒量为8×103TCID50/mL;病毒增殖的最佳吸附时间为37℃,60 m in;最佳收毒时间为接毒后60~84 h;病毒最佳冻融次数为反复冻融3次。     

新生仔猪红黄痢二联灭活疫苗的研制与应用Ⅰ——C型魏氏梭菌生物学特性研究

[目的]研究C型魏氏梭菌C59-2菌株的生物学特性。[方法]将该菌株接种于适宜培养基,进行毒素致死性试验和免疫原性试验。[结果]C型魏氏梭菌C59-2菌株在厌气肉肝汤和血液琼脂平板上生长良好,生化特性与魏氏梭菌一致;该菌在厌气肉肝汤中培养物的上清液0.0001ml静脉注射可致小鼠100%死亡,0.2ml静脉注射可使家兔全部死亡;免疫原性试验表明,该菌株制备成疫苗后免疫家兔,攻毒保护率可达75%。[结论]C型魏氏梭菌C59-2毒株适合于疫苗生产。     

鸡传染性贫血病毒、传染性法氏囊病毒与大肠杆菌混合感染的诊治

鸡传染性贫血与传染性法氏囊病是由病毒感染导致的鸡主要免疫抑制病,雏鸡同时或先后感染此2种病原,即会使二者相互促进,增强感染力和致病力,进一步继发细菌感染,造成严重损失。某个体养殖户鸡群发生以消瘦、贫血为主的鸡病。根据发病特点、临床症状、剖检、实验室检查确诊为鸡传染性贫血病毒、传染性法氏囊病毒与大肠杆菌混合感染。采取及时隔离、加强消毒及饲养管理、选用敏感药物、饲料饮水加药控制继发感染等综合防制措施,有效控制了该病。     

牛支原体P33蛋白的原核表达及鉴定

为了实现牛支原体P33蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验在不改变P33蛋白氨基酸序列的情况下,根据GenBank发表的P33基因序列(登录号为AIA33909.1)设计并合成特异性引物,利用PCR法扩增P33基因,进行双酶切并将基因片段克隆到pET28a(+)载体中,构建重组质粒pET28a(+)/P33,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后进行原核表达,再利用His-tag镍柱纯化P33重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:成功扩增得到牛支原体P33基因,其核苷酸序列长度为710 bp,重组菌株在温度为30℃、以0.5 mmol/L IPTG诱导12小时时,P33蛋白表达量最高;经His-tag镍柱纯化后P33蛋白在33 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中表达牛支原体P33重组蛋白。     

重组日本乙型脑炎病毒NS1的可溶性表达及抗原性分析

根据日本乙型脑炎病毒(JEV)Whe株非结构蛋白质1(NS1)的基因序列,设计引物,利用反转录PCR从实验室保藏JEV Whe株中克隆NS1全长序列,并将其插入pET28a表达载体,构建重组表达质粒NS1-pET28a,转化大肠杆菌BL21(ED3),经IPTG诱导,得到可溶性表达的融合蛋白质His-NS1。结果表明,该融合蛋白质分子量为46ku,大量表达于上清中。镍离子亲和层析柱进行纯化得到His-NS1蛋白质,经Western-blot检测,证明其具有良好的免疫学活性,这为进一步研究JEV NS1的功能及应用奠定了基础。     

猪乙型脑炎病毒E-Ⅲ抗原域蛋白间接ELISA的建立及应用

该研究利用纯化后的流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)E-Ⅲ抗原域蛋白,将其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法.试验的最佳反应条件为:最佳抗原包被浓度为17.5 μg/mL,血清抗体稀释度为1∶4,酶标二抗稀释度为1∶5 000,封闭液和稀释液用含0.4％ BSA的PBST.采用该方法对127份临床样品进行检测,结果显示,与商品试剂盒检测结果比较符合率达到90.00％.因此,该研究建立的流行性乙型脑炎间接ELISA检测方法具有良好的稳定性和可重复性,并具有较高的特异性和敏感性.     

高致病性蓝耳病与猪瘟混合感染的诊断

2007年6月,湖北某猪场发生以妊娠母猪流产、死胎,仔猪及育肥猪体温升高,发病快,死亡率高为主要临床表现的疾病.根据流行病学调查、临床症状、剖检病变和实验室诊断,确诊为高致病性蓝耳病与猪瘟的混合感染.     

鸡传染性贫血病研究进展

鸡传染性贫血(Chicken infectious anemia,CIA)是由鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)引起的一种以雏鸡再生障碍性贫血和全身淋巴组织萎缩为主要特征的病毒性传染病,是鸡重要的免疫抑制病之一。CIA主要发生于2～4周龄的雏鸡,病鸡的造血器官受损,导致雏鸡贫血和成鸡免疫抑制。1979年Yuasa等[1]首次在