伪狂犬病毒PK基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK/gI缺失疫苗株为亲本株,提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段。将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA。用限制性内切酶SacⅠ NdeⅠ缺失质粒P8-AA中PK基因的2 218 bp片段,在此缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-CI-VP1中含绿色荧光蛋白基因和VP1基因的完整表达盒,构建出可用于同源重组的转移载体P8-EGFP-VP1。     

秀丽隐杆线虫fat-1基因密码子优化、克隆及家兔表达载体构建

提取秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)总RNA,采用RT-PCR法扩增出fat-1基因cDNA全长.根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的fat-1 cDNA序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因(命名为opfat-1).将扩增的fat-1 cDNA和opfat-1基因分别与pGEM-T Easy和pUC57载体连接,转化大肠杆菌DH5α,获得2种重组克隆子.2种重组子经双酶切后获得的目的片段分别定向克隆入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组表达载体,并对其进行PCR、限制性内切酶酶切分析和测序鉴定,结果表明,成功构建了fat-1基因家兔表达载体pEGFP-opfat-1和pEGFP-fat-1,且读码框正确.     

新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子表达载体的构建

为了进一步研究新牧1号苜蓿抗逆相关基因MvNHX1启动子的功能,采用双酶切的方法,用核酸内切酶SacⅠ和NcoⅠ分别双酶切pCAMBIA1304质粒和阳性重组质粒pEASY-T1-simple-pMvNHX1,然后回收目的片段。通过T4DNA连接酶将目的片段和空载体相连后获得连接产物。将连接产物导入到宿主菌DH5α,通过画板,卡那霉素筛选后挑单菌落摇菌。然后用菌液PCR及双酶切鉴定该载体后,用冻融法将其导入农杆菌EHA105。结果表明,成功培养出含有抗逆相关基因MvNHX1启动子pMvNHX1∶GUS∶EHA105的菌落;成功构建出新的植物表达载体pMvNHX1∶GUS。     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.     

Metallothionein克隆载体及表达载体的构建及转化矮牵牛的初步研究

Metallothionein基因位于文库克隆载体pTriplEx2上,活化菌液并用限制性内切酶SfiI酶切,同时酶切添加了SfiI酶切位点的环状pMD-18TM,回收目的片段和载体并连接,经过酶切和PCR验证,成功构建克隆载体;再用XbaI和SmaI分别双酶切克隆载体和表达载体pc2301,回收目的片段和表达载体并连接,经酶切和PCR验证,成功构建含有目的基因的表达载体,进而转化植物获得耐重金属的植物株系。初步验证转化后的植株具有抗击重金属的能力。     

SARS病毒S蛋白S1和S2片段的合成及在大肠杆菌中的表达

[目的]通过拼接完成对SARS S蛋白的上下游序列S1和S2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的S1和S2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成SARS香港株S蛋白上下游2个片段S1和S2;构建S1和S2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-S1和pET28a-S2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到S1和S2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续SARS疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。     

Bt基因介导的大豆抗蚜虫表达载体的构建

[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。     

甘薯抗线虫病相关基因片段克隆及序列分析初步研究

依据甜菜抗线虫病基因(Hs1pro-1)序列设计引物片段,对甘薯高抗线虫病品种金山25的总DNA进行PCR扩增,获得1条600 bp左右的特异片段.序列测定及同源性检索表明,克隆序列与甜菜的Hs1pro-1基因具有一定的同源性.     

大豆查尔酮还原酶1基因的克隆及转化

【目的】克隆大豆查尔酮还原酶1(CHR1)基因,以构建的过表达载体pCAMBIA3301-CHR1转化大豆,获得含有CHR1基因的阳性植株,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】以大豆基因组DNA为模板,通过PCR扩增克隆CHR1基因,构建植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,对其进行PCR及双酶切鉴定。采用农杆菌介导法将该载体转入大豆"吉农28"中,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,对CHR1基因mRNA相对表达量进行荧光定量PCR检测。【结果】克隆得到的CHR1基因大小为1 100bp。成功构建了植物过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,将其转化大豆后,通过PCR检测获得T1代转基因大豆植株12株;Southern杂交检测结果显示,CHR1基因以单拷贝形式整合入大豆基因组中;荧光定量PCR检测结果显示,转基因植株的CHR1mRNA相对表达量高于非转基因大豆植株。【结论】成功构建了过表达载体pCAMBIA3301-CHR1,并获得了CHR1基因表达量高的转基因大豆。     

大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体。[方法]利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因。用限制性内切酶EcoRI和Not1分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体。[结果]扩增的大豆疫霉菌pspgl基因成熟肽片段大小为1250bp。用基因特异性g}物扩增阳性重组子,可得到大小为1200bp的片段。而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1200和1700bp两条带,多出来的400bp恰好符合载体部分的大小。将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中。[结论]该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础。     

甜瓜蔗糖合成酶基因(CmSS1)反义表达载体的构建及遗传转化

以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-CmSS1和表达载体pBI121,再用T4 DNA连接酶将回收的目的片段反向与pBI121连接。结果证明,CmSS1反向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmSS1的重组质粒;利用农杆菌介导法将反义CmSS1基因转化甜瓜,经PCR检测,得到5株转基因植株。这为以后研究甜瓜蔗糖合成酶的活性调节机制及通过基因工程手段研究甜瓜SS的活性奠定了基础。     

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。     

胡萝卜抗冻蛋白基因克隆及植物表达载体构建

以胡萝卜品种 Autumn King的幼苗为材料 ,用 CTAB法提取其基因组 DNA,以 PCR ( Polym eraseChain Reaction)的方法在体外扩增出胡萝卜抗冻蛋白基因 ( afp) ,以 p UCm - T Vector为载体构建成胡萝卜 afp的克隆载体 p TAF,用 Eco R 消化重组质粒 p TAF使其线性化 ,再用 DNA聚合酶 Klenow大片段补平末端 ,然后用Xba 消化 ,获得一末端粘 ,一末端平的目的片段 ( afp)。植物表达载体 p BI12 1用 X ba 和 Sma 双酶切 ,获得一末端粘 ,一末端平的线性质粒。将目的片段与线性质粒在 T4DNA连接酶的作用下进行定向连接 ,构建成胡萝卜 afp的植物表达载体 p BAF     

番茄生长素应答因子ARF1基因RNA干涉载体的构建及其对番茄的转化

将番茄生长素应答因子家族成员之一ARF1中的500bp左右的特异片段导入到植物载体pBI121中,构建成RNAi表达载体(pBI121-ARF1),通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶,经组织培养和抗性筛选获得再生植株.PCR检测再生植株,初步鉴定为阳性植株,为后续进一步鉴定该基因功能奠定了基础.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因植物表达载体的构建

应用RT-PCR技术克隆了猪传染性胃肠炎病毒TGEV-JL株S基因全序列,将其连接到pMD18-T载体。经SacⅠ和BamHⅠ酶切鉴定,其产物全长4320bp。测序后与TH-98等8个TGEV毒株的S基因序列进行比对,同源性为97.6%～99.8%。将该基因插入植物表达载体pBI121的CaMV35S启动子下游,构建高效植物表达载体,转入根癌农杆菌EHA101中。结果表明:成功构建了重组植物表达载体pBI121-S,获得农杆菌工程菌。     

石斑鱼生长激素基因的合成及其在拟南芥中的表达

为了使石斑鱼生长激素基因适合在植物中表达,重新合成了石斑鱼生长激素基因,对其密码子进行了优化,把合成的基因构建于植物表达载体pBI121上并转化模式植物拟南芥,获得了30个转基因抗性植株。对24株PCR阳性苗进行Northernblotting分析,结果表明,鱼类生长激素基因可以在转基因植物中表达,其表达在不同的转基因植株中存在明显差异,表达最强的植株与最弱的植株相比,二者表达量差异达到43倍。     

抗除草剂bar基因植物表达载体的构建与抗性功能的检测

摘要：根据GenBank上发表的抗除草剂har基因序列设计引物,通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,获得har基因片段,连接在pMD18-T中间克隆载体上,用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切后连接到pBI121上获得pBI121-bar。用HindⅢ内切酶切含Bt-4AB基因的质粒并与pBI121-bar重组,重组质粒命名为pBI121-bar／Bt。重组质粒导人农杆菌LBA4404工程菌中,转化新海24号棉花胚性愈伤组织。PPT抗性实验证明,构建的pBI121-bar／Bt载体获得抗除草剂抗性,并筛选出PPT临界筛选浓度为3．0mg／L。     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因农杆菌工程菌株的构建

采用固相亚磷酸三酯法人工化学合成了人胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｈｕＩＧＦ－Ｉ）基因的４条寡核苷酸 片段，再通过片段１、２与３、４末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平及酶切连接成为完整的ｈｕＩＧＦ－ＩＤＮＡ片段，用 ＥｃｏＲ　Ｉ／ＰｓｔＩ酶切后克隆于 ｐＧＥＭ Ｔ－Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ，经测序证明所得 ＤＮＡ序列与设计的序列完全一致；选用植物 偏爱密码子校正了启始密码子ＡＴＧ下游的６个密码子，并在ＡＴＧ处增加Ｋｏｚａｋ序列后，插入ｐＢＩ１２１的ＢａｍＨＩ／ ＳａｃＩ位点，构建了以 ３５Ｓ为启动子的植物表达载体；以 Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ切下“３５Ｓ－Ｋｏｚａｋ－ＩＧＦ－Ｉ－ＮＯＳ（ｔｅｒ．）”插入 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００之Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ位点，构建成ｈｕＩＧＦ－Ｉ植物表达载体；通过ＣａＣｌ２直接转化法将表达载体导入农 杆菌ＥＨＡ１０５（Ｒｉｆ．ｒ），并以菌落原位杂交技术和 ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ对重组农杆菌进行了筛选，所获得的重组农杆菌菌株为培育ｈｕＩＧＦ－Ｉ豆药用植物奠定了基础。     

牡丹ACC氧化酶基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

利用CTAB改良法提取牡丹洛阳红花瓣总RNA,通过反转录酶和设计的ACC氧化酶基因特异引物合成709bp目的片段,进行测序和比对,以确定目的片段的正确性。在709bpACC氧化酶基因片段和pBI121植物表达载体上选择合适的酶切位点,进行XbaⅠ和SmaⅠ双酶切。将709bp片段上切下的510bp片段反向插入pBI121植物表达载体35S启动子后面,构建成含510bp牡丹ACC氧化酶基因反义表达载体。最后采用电击法转化进感受态农杆菌GV3101,以备用于花粉管通道法转化牡丹。