烟草和拟南芥表皮毛中特异表达iaaM后的遗传效应

利用色氨酸单加氧酶基因iaaM与拟南芥表皮毛特异表达GL2基因启动子重组后,构建了在植物表皮毛细胞中特异表达iaaM基因的重组基因载体;采用根癌农杆菌叶盘转化法将重组基因转化到烟草WS38(对照)中,筛选和鉴定出了6株转化烟草植株;将该重组基因以根癌农杆菌花序浸渍法转至拟南芥(Colombia ecotype,对照),筛选出9株拟南芥转化植株,并对稳定转化的转基因植株表皮毛进行观察。结果表明:转基因烟草表皮毛较对照植株显著增长,其长度最长为对照的2.2倍,但转基因拟南芥表皮毛长度与对照间无显著差异。对烟草幼叶进行生长素浓度检测,转iaaM基因烟草吲哚乙酸含量显著提高,说明iaaM在烟草表皮毛细胞中表达,使其合成和积累更多的生长素;转基因拟南芥和烟草表皮毛密度均较对照显著增加,证明植物表皮毛发育模式中GL2表达的特异性受细胞内生长素的影响。     

‘南通小方柿’DkADH1基因遗传转化及功能分析

[目的]研究‘南通小方柿’(Diospyros kaki Linn.‘Nantongxiaofangshi’)乙醇脱氢酶基因DkADH1的功能,阐明其在柿果脱涩过程中的作用。[方法]构建了DkADH1基因植物双元表达载体,通过农杆菌介导法将该基因转入番茄中。以转基因和非转基因番茄株系的不同组织为材料,钨酸钠-钼酸钠比色法测定可溶性单宁含量,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测原花青素(PA)合成途径相关基因的表达情况。[结果]经PCR和RT-PCR检测,获得了3个转DkADH1基因番茄株系。过量表达DkADH1基因的转基因番茄植株的叶片、花、果实中可溶性单宁含量均显著低于非转基因番茄植株。qRTPCR显示:转基因植株不同组织中PA合成途径相关基因F3’5’H、LAR、MYB4和PAL的表达量与非转基因植株相比均显著下调。[结论]DkADH1能降低植物可溶性单宁的含量并抑制其生物合成途径相关基因的表达,与柿果脱涩密切相关。     

拟南芥钴胺素合成相关蛋白CSRP基因克隆及其功能分析

以拟南芥为研究对象,根据已知的生物信息数据,通过反向遗传学的方法,对与钴胺素合成相关蛋白CSRP基因进行分子克隆,得到该基因的基因组序列和cDNA序列,构建二元重组质粒,利用根癌农杆菌介导的花浸泡转基因方法分别转化突变体和野生型植株,进行互补试验和过表达试验,筛选转基因植株,并进一步预测其编码蛋白的亚细胞定位于叶绿体中.结果表明,在突变体中转入该基因后,转基因植株恢复野生型的表型,而在过表达的转基因植株中表型更为明显,即生长旺盛,晚花.说明该基因对于拟南芥的营养生长起促进作用,由于其功能预测与钴胺素合成相关的蛋白,推测其可能在植物营养生长中起作用.     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的功能分析

运用克隆的苎麻纤维素合成酶(BnCesA1)基因cDNA及植物表达载体pWM101,构建了35S启动子控制的苎麻BnCesA1基因核心区段反义融合表达载体(pWM-BnCesA),并通过根癌农杆菌介导法将其转化至模式烟草WS38,获得了转基因烟草.对转基因烟草植株进行的分子检测和初步组织学研究表明,转反义BnCesA1基因核心区段对纤维素的合成产生干扰,植株叶柄切片初生组织细胞较野生烟草松散,其基本组织细胞涨大,间隙也相应增大,证实BnCesA1基因的纤维素合成功能,表明BnCesA1基因在植物初生组织和次生组织的细胞壁合成中都发挥作用.     

超表达水稻MGD基因(OsMGD)烟草植株的耐低磷胁迫能力

【目的】研究超表达OsMGD基因烟草植株在低磷条件下的生长情况,为明确OsMGD基因对植物耐低磷胁迫的影响机理奠定基础。【方法】通过构建表达载体pGWB2-OsMGD和农杆菌介导的转化方法,获得超表达OsMGD基因烟草植株,用磷浓度为5μmol/L的HS营养液对转基因烟草植株进行低磷处理后,研究转基因烟草植株MGD活性、脂质和脂肪酸含量、叶绿素含量、根系鲜质量、根冠比和磷含量的变化情况。【结果】超表达OsMGD基因烟草植株中MGD活性增加了1~3.5倍;在转基因烟草植株中,半乳糖脂(MGDG和DGDG)、磷脂和总脂肪酸含量均显著高于野生型植株,但是转基因烟草植株中的脂肪酸组分与野生型相比无显著差异。低磷处理后,转基因烟草植株的生长情况明显优于野生型植株,转基因烟草植株中叶绿素含量、根系鲜质量和根冠比均显著高于野生型;在正常和低磷条件下,转基因烟草植株中的磷含量与野生型相比无显著差异。【结论】超表达OsMGD基因能增加烟草植株的细胞膜脂含量,使植物体内累积大量半乳糖脂和磷脂,从而提高了烟草植株耐低磷胁迫的能力。     

实现转基因植物外源基因高表达的途径与安全性

近十年来,许多重要作用品种的遗传转化相继成功和得到可育的转基因植株,多种不同外源基因被导入大量不同植物。但由基因沉默、位置效应等原因,外源基因在转基因植株中不表达或表达水平低下,同时不同植株个体之间也存在差异。因此如何在转基因植株中实现有效表达和维持高水平稳定遗传,就是农业生物技术工作者面临的首要问题。     

利用转基因番茄表达血管内皮生长因子的研究

【目的】应用基因工程技术,获得表达血管内皮生长因子（VEGF）的转基因番茄植株,为以番茄作为生物反应器生产药用蛋白奠定基础。【方法】利用植物偏好的密码子改造合成VEGF基因全长,构建植物表达载体p1390RVEGF,通过农杆菌菌株EHA105介导将其T-DNA区转入到番茄细胞中,再生后获得转基因番茄植株,对其进行分子和蛋白水平检测。【结果】成功构建了植物整株表达载体p1390R-VEGF,建立了高频的番茄再生培养体系;PCR检测、Southern blot和Western blot检测结果表明,VEGF基因已经转入番茄中,并成功得到了表达。【结论】得到了转基因番茄植株和果实,且VEGF蛋白有良好的抗原性。     

转录因子ABP9基因过表达对植物生长发育的影响分析

【研究目的】为分析玉米ABA/逆境响应转录因子ABP9基因过量表达对植物生长发育的影响以利用该基因开展抗逆分子育种。【方法】本研究构建了35S启动子驱动ABP9组成型表达的植物表达载体,获得了过表达ABP9基因的拟南芥转基因株系,并在正常生长条件下,比较了转基因植株和野生型在种子萌发、营养生长和生殖生长阶段的形态和生理变化,分析了可能的分子机制。【结果】结果表明,正常生长条件下,转基因植株与野生型相比表现出萌发,幼苗生长以及开花阶段的生长抑制;气孔开度减小,叶片内源ABA含量降低;ABA信号传导基因表达增强,而ABA合成基因表达降低;而且这些效应在ABP9基因表达相对较强的转基因株系中表现更明显。【结论】说明ABP9基因过量在正常生长条件下即诱导转基因植株产生耐逆反应,抑制植株的生长发育。因此,在利用ABP9基因进行转基因抗逆育种时须考虑控制ABP9基因适时适量表达。     

橡胶延伸因子REF基因的克隆、转化及功能分析

取巴西橡胶树新鲜橡胶胶乳,利用改良CTAB法提取胶乳总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank中REF基因序列的报道,设计特异性引物,Taq酶扩增,获得REF基因并构建DHN pBin 438-REF植物表达载体。利用叶盘转化法侵染橡胶草无菌幼嫩叶片,通过RT-PCR方法鉴定阳性植株,对其可溶性糖、胶乳和蛋白质含量等进行检测。结果表明,转基因橡胶草可溶性糖质量浓度为0.053 8g/L,约是野生型橡胶草的2倍;橡胶是野生型植株橡胶的1~3倍;而转基因橡胶草中REF基因在蛋白质水平高效表达,其中根和花梗中REF基因高效表达。本研究通过农杆菌介导的遗传转化,获得5株阳性转基因橡胶草植株,分子生物学结果表明,REF基因可在橡胶草中稳定表达,并显著地提高橡胶草中合成天然橡胶的生物量。     

过表达蝶呤还原酶PTR1基因促进植物叶酸合成的研究

叶酸是生物体维持正常生命活动所必需的小分子代谢物,还原态的蝶呤参与叶酸的合成。通过利用组成型启动子驱动依赖NADPH的蝶呤还原酶基因（NADPH-dependent pterin reductase gene, PTR1）在模式植物拟南芥和烟草中进行过表达,探讨了来源于利什曼原虫的PTR1基因对植物叶酸合成代谢的影响。结果表明,在过表达PTR1的转基因拟南芥和烟草植株中,叶酸含量有不同程度的升高,其中转基因拟南芥的5-甲酰四氢叶酸有显著提高,而转基因烟草中5-甲基四氢叶酸有显著提高。说明将来源于原生动物的蝶呤还原酶引入植物,可以促进转基因植物中叶酸的合成代谢,为深入了解植物叶酸合成代谢的规律奠定了基础。     

转耐辐射球菌irrE基因提高拟南芥盐胁迫耐受性的表型分析

耐辐射球菌中的irrE基因作为一种全局性调节因子,在抵御极端辐射照射时起着至关重要的作用。利用农杆菌介导的花序浸染法,将irrE基因转化拟南芥,筛选和鉴定出表达irrE的植株,并分析了转基因植株的盐胁迫耐受能力。结果显示,转irrE拟南芥表现出对盐胁迫的耐受性提高;在盐胁迫下,转基因拟南芥体内脯氨酸含量比野生型有明显的提高。RNA半定量分析显示转基因植株中AtNHX1表达水平升高。因此推测irrE基因在转基因拟南芥中调控了AtNHX1的表达,引起了植株的盐胁迫耐受性提高。     

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaA QP1属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫.构建植物表达载体pCAMBIA 1304-MaA QP1获得转基因拟南芥植株,GUS染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部.通过Southern blot检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验.与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力.     

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaAQP1 属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫。构建植物表达载体pCAMBIA1304-MaAQP1获得转基因拟南芥植株,GUS 染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部。通过Southern blot 检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验。与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

陆地棉GhBI-1基因在拟南芥中的异位表达及耐盐性研究

前期工作中,我们从陆地棉基因组中分离了GhBI-1基因全长cDNA,构建了GhBI-1过量表达载体并转化拟南芥。本研究在此基础上,利用卡那初步筛选获得转基因拟南芥,通过PCR进一步验证,得到具有卡那抗性并且遗传稳定的T3代纯合株系。利用不同浓度NaCl处理野生型和转GhBI-1基因拟南芥,结果表明,转基因拟南芥在200 mmol/L NaCl胁迫后,萌发率和生长情况要好于野生型拟南芥,过量表达GhBI-1基因能够提高拟南芥耐受盐胁迫的能力。     

根癌农杆菌介导油菜CBF1基因转化拟南芥

[目的]为油菜CBF1基因应用于作物抗逆遗传改良提供理论依据。[方法]采用根癌农杆菌介导法将油菜CBF1基因转入拟南芥,筛选抗性转基因拟南芥植株,进行PCR检测和GUS染色。[结果]与不抗潮霉素的野生型拟南芥幼苗相比,对潮霉素具有抗性的转基因拟南芥幼苗的叶片比较大,根特别长。PCR检测表明38株抗性拟南芥植株中有29株能扩增出与目的基因大小一致的条带,阳性率为76.3%,而野生型拟南芥植株没有扩增出相应条带。阳性PCR扩增产物的测序结果表明油菜CBF1基因已经转入到拟南芥。GUS染色表明有22株转基因拟南芥植株呈现阳性。[结论]油菜CBF1基因可以整合到拟南芥基因组并能稳定表达。     

白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响

目的目前对植物SPL8的基因功能研究主要集中在开花和育性方面,而其在干旱胁迫响应中的作用却鲜有报道。本文克隆、分析了白桦BpSPL8启动子,并研究了BpSPL8基因在拟南芥中响应干旱胁迫的功能。方法通过PCR克隆技术得到了白桦BpSPL8启动子;利用PLACE和PlantCARE软件对BpSPL8启动子顺式作用元件进行了预测。构建了BpSPL8启动子驱动GUS（β-葡萄糖苷酸酶编码基因）的植物表达载体,并采用浸花法将其转化至拟南芥中;继而利用GUS染色分析了BpSPL8启动子的组织表达模式;同时对BpSPL8在PEG处理下的表达水平进行了qRT-PCR分析。最后,以过表达BpSPL8拟南芥为材料来探究BpSPL8在干旱胁迫下的生物学功能。结果启动子元件分析显示,BpSPL8启动子中含有组织特异表达、光响应、激素响应及多个胁迫响应元件。GUS染色结果表明,BpSPL8启动子可在拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序中启动GUS基因表达。BpSPL8基因在PEG处理下的野生型白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的表达趋势。干旱胁迫下,过表达BpSPL8拟南芥的存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型;两个已知的抗逆基因DR29B和P5CS1在干旱处理后的野生型和转基因拟南芥中均上调表达;但在转基因拟南芥中呈现出延迟上调的表达模式。结论异源过表达白桦BpSPL8能够降低拟南芥的耐旱性,并在干旱胁迫下影响抗性基因DR29B和P5CS1的表达模式。      

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。     

大豆GmbZIP16的抗旱功能验证及分析

【目的】通过分析干旱条件下大豆的转录组数据,筛选获得大豆锌指蛋白GmbZIP16,对其进行功能验证,确定GmbZIP16参与大豆抵抗干旱的分子机理。【方法】大豆干旱转录组数据分析得到上调倍数较高的锌指蛋白GmbZIP16,以大豆cDNA为模板克隆获得GmbZIP16。并通过In-Fusion连接酶技术,构建pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16表达载体。通过液氮冷冻法将重组载体pCAMBIA1302- GmbZIP16和pCAMBIA3301-GmbZIP16分别转入农杆菌GV3101和大豆发根农杆菌K599的感受态细胞中,通过农杆菌侵染拟南芥花序以及大豆子叶节技术,产生过表达拟南芥植株以及过表达大豆毛状根复合体植株。通过半定量RT-PCR和qRT-PCR分析,确定GmbZIP16在转基因拟南芥和大豆毛状根中能够超表达。分别将正常条件下生长2周龄的转基因和野生型拟南芥植株转移至含有不同PEG浓度（6% PEG和8% PEG）的MS0培养基上继续培养7 d,观察转基因拟南芥和对照野生型拟南芥之间的生物量差异;利用qRT-PCR分析转基因拟南芥和野生型拟南芥植物体中胁迫相关的基因表达情况。将生长良好的转GmbZIP16大豆毛状根复合体施加25% PEG处理1周后,分别采取转GmbZIP16大豆毛状根复合体和转空载体大豆毛状根复合体的叶片,用酶标仪测定植株的脯氨酸、丙二醛和叶绿素的含量。【结果】通过PCR技术扩增得到正确的GmbZIP16序列,通过农杆菌转化技术得到2个稳定过表达的转GmbZIP16拟南芥株系。通过对转基因拟南芥的表型鉴定发现转基因拟南芥在干旱处理下的生物量（鲜重和根长）及存活率比野生型显著提高。在过表达GmbZIP16拟南芥植株中,一些与胁迫相关的基因的表达要高于在野生型,如RD29B、DREB2A和P5CS。转GmbZIP16大豆毛状根复合体植株在25% PEG处理1周后,大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量要显著高于转空载体大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量,而转GmbZIP16大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量显著低于转空载体大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量。【结论】在拟南芥中过表达大豆GmbZIP16提高了转基因拟南芥的抗旱性。过表达GmbZIP16可以提高转基因大豆毛状根复合体对干旱的抗性。GmbZIP16提高植物的抗旱性主要是通过影响与抗逆相关基因的表达来实现的。     

禽流感病毒 HA 基因在拟南芥中的表达

将H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因构建到植物表达载体,经农杆菌法转入拟南芥基因组中,酶联免疫吸附(ELISA)测定分析T2代转基因株系,据OD值筛选获得HA基因高效表达株系;RT-PCR及Western blot分析进一步证实,这些转基因株系均可转录HA基因,翻译形成相应的蛋白质.拟南芥叶片中表达积累的HA蛋白经亲和层析纯化,Western blot分析检测到1条分子量为65 ku的蛋白质带,与预期的HA蛋白大小完全一致,没有发生蛋白质降解现象.表明禽流感病毒HA蛋白可在植物细胞中稳定表达,植物可用于生产禽流感疫苗.