猪CD151重组抗原表达及其免疫血清的PRRSV感染抑制作用

用RT-PCR从猪巨噬细胞中扩增CD151胞外区编码序列,将其插入含细胞毒性T细胞相关抗原4胞外区序列的表达载体,重组载体转化大肠杆菌,SDS-PAGE检测重组蛋白表达;用包涵体纯化和尿素变性与复性法获得可溶性蛋白,纯化蛋白免疫小鼠,ELISA测定免疫血清抗体效价,Western-blot验证免疫血清特异性;以处理细胞或处理病毒方式,用免疫血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染抑制试验。结果表明:重组菌表达预期的32ku重组蛋白,获得的可溶性重组蛋白纯度较高;免疫血清抗体效价达1∶170 000,在猪巨噬细胞中能检测到预期的29ku蛋白,能抑制PRRSV感染MARC-145细胞,但有毒株差异性,处理病毒的感染抑制作用较强。结果提示猪CD151免疫血清能以结合细胞和结合病毒方式抑制PRRSV感染。     

表达猪Viperin蛋白重组腺病毒的构建及其对PRRSV复制的抑制作用

为研究猪Viperin蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的抑制作用,通过RTPCR方法扩增猪Viperin基因,并克隆入腺病毒穿梭载体p Ad Track-CMV,经菌液PCR、酶切鉴定后进行测序。将PmeⅠ内切酶线性化的重组穿梭载体质粒(p Ad Track-s VIP)电转化大肠杆菌BJ5183,与腺病毒骨架载体p Ad Easy-1进行同源重组,提取重组后的腺病毒质粒,经内切酶PacⅠ线性化后转染HEK-293A细胞,装配成完整的病毒粒子r Ad-s VIP。重组腺病毒r Ad-s VIP感染细胞后,可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR、Western blot检测结果表明,重组腺病毒r Ad-s VIP可正确表达猪Viperin蛋白,且表达的猪Viperin蛋白具有良好的反应原性,对PRRSV的复制具有明显的抑制作用。     

人IL-32-IgG4（Fc）融合蛋白在CHO/DG44细胞中的表达

【目的】构建人白细胞介素32(IL-32)和IgG4 Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOp-tiVEC,建立稳定转染的中华仓鼠卵巢细胞(CHO/DG44)克隆,并检测其重组蛋白的表达。【方法】用PCR方法从脂多糖(LPS)激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32蛋白基因,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVEC载体上,构建重组质粒IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,并进行酶切和测序鉴定。采用脂质体法,将重组质粒线性化后转染CHO/DG44细胞,进行RT-PCR检测,筛选阳性克隆,并对筛选的阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压筛选。利用ProteinG-Agarose亲和层析纯化转染CHO/DG44细胞培养上清液中的融合蛋白IL-32-IgG4(Fc),通过SDS-PAGE、Western-blot对融合蛋白IL-32-IgG4(Fc)的表达和生物学活性进行检测。【结果】PCR扩增获得了长度为564 bp的人IL-32蛋白基因cDNA,经测序与GenBank报道的序列一致。真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得了IL-32蛋白基因片段,其长度为564 bp。筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,其分子质量约为50.0 ku,与预期结果一致。MTX加压后,IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的表达量明显升高。【结论】成功构建了人IL-32蛋白融合基因的真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。     

重组腺病毒介导的猪瘟 E0基因在山羊乳腺中的表达

为使猪温病毒(CSFV)E0蛋白在奶山羊乳腺中得以合成和分泌,一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFVE0基因通过腺病毒穿梭载体被插入到腺病毒质粒中,将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0。为证明其有效性,用Ad-hisE0感染293A细胞,实时定量PCR检测显示E0基因的表达显著提高。用Ad-hisE0分别感染牛乳腺上皮细胞和泌乳期山羊乳腺,SDS-PAGE和Western blot分析结果显示出E0蛋白分别位于26ku和48ku处的2条特异性条带。证实构建的腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。     

抗猪FcγRⅡb多抗阻断猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖增强作用研究

为验证猪FcγRⅡb在抗体依赖增强(ADE)作用中的功能,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清中提取IgG并制备F(ab′)2片段,将104 TCID50的PRRSV病毒与80μg/mL的F(ab′)2片段或抗PRRSV阳性血清(中和效价1/5.9,经128倍稀释)混合,共同感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)和Marc-145细胞,发现亚中和滴度的阳性血清能显著增强病毒对PAM的感染,但不能增强病毒对Marc-145细胞的感染;而F(ab′)2片断不能增强病毒感染;用兔抗猪FcγRⅡb多抗孵育PAM细胞,再用上述病毒与阳性血清复合物感染PAM,结果阳性血清对病毒感染的增强作用受到明显抑制。表明猪FcγRⅡb能够介导PRRSV ADE作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵受体唾液酸黏附素的表达与纯化

为了探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)假定受体唾液酸黏附素(sialoadhesin,Sn)的结构生物学信息及其在PRRSV入侵过程中所发挥的作用,利用昆虫表达系统(果蝇胚胎细胞,S2细胞)表达了猪源Sn v-set Ig-like结构域重组蛋白,并进行了Western blotting检测、质谱检测及镍柱纯化试验。结果表明,成功表达了目的重组蛋白,表达的重组蛋白序列与Sn v-set Ig-like结构域目的蛋白序列100%匹配,且获得的重组蛋白具有生物学活性,纯度高达99%。     

猪波形蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的抑制作用

为了研究波形蛋白在介导猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染细胞过程中的作用,利用RT-PCR方法从PRRSV非易感细胞系猪肾细胞系PK-15细胞中扩增目的基因,克隆入pET-28a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达的重组猪波形蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定和纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用病毒抑制试验检测重组猪波形蛋白及多克隆抗体在PRRSV感染Marc-145细胞过程中的作用。结果表明,成功扩增猪波形蛋白基因并克隆入pET-28a载体,经诱导后得到高效表达,纯化后免疫兔子产生高价血清抗体(105)。病毒阻断结果表明,猪波形蛋白及多克隆抗体均能阻断PRRSV感染Marc-145细胞。这为以波形蛋白为基础的PRRSV受体阻断抑制剂的研究提供了实验依据。     

表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建

以PRRSV FJ-1a株为模板,采用RT-PCR法分别扩增出GP2a/GP2b-3、GP3、GP4、GP5和M蛋白基因片段,双酶切后插入穿梭质粒pDC316.利用AdMaxTM法,将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad-GP2a/GP2b-3、Ad-GP3、Ad-GP4、Ad-GP5和Ad-M.重组腺病毒滴度为107.7～109.0TCID50·mL-1,而以Ad-GP5滴度最低,仅为107.7TCID50·mL-1.PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性,确证重组病毒均能稳定携带目的基因.对目的基因转录的RT-PCR鉴定结果显示,重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA.表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得,为进一步研制PRRSV基因工程疫苗,解析主要囊膜蛋白功能奠定基础.     

表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定

利用pVAX1载体的表达元件CMV启动子和poly(A)多聚腺苷酸信号构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因(F)的重组犬腺病毒。首先,利用酶切、连接等实验方法构建了含CDV启动子F蛋白基因表达盒的转移质粒pVAXΔE3LPF。再以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建重组质粒pCAV-2-pVAXLPF,利用脂质体介导方法转染MDCK细胞,转染3次后,细胞出现了典型的犬腺病毒感染样病变。电镜负染和切片观察、酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明,成功构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因的重组犬腺病毒,表达的融合蛋白分子质量为72ku。在MDCK细胞上连续传30代试验表明重组病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遗传稳定性。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒结构蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达

猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是严重威胁养猪业的病毒性疾病,疫苗免疫是预防该病的最有效途径,PRRSV糖蛋白GP5和基质蛋白M融合后制成的基因工程疫苗能够有效激发机体产生免疫应答。通过在GP5和M基因的5′端依次加上组氨酸标签序列、信号肽序列,利用Linker(GP)序列将GP5和M基因连接构建融合表达GP5和M蛋白的重组质粒pMD18T-SignalP-His-GP5-M。以该质粒为模板,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒。结果表明,用包装的腺病毒感染乳腺上皮细胞,测得最佳感染复数(MOI)为25,定量PCR和Western blot方法均检测到GP5-M的表达。大量扩增腺病毒并使用不连续氯化铯浓度梯度离心纯化病毒,使用纯化的病毒灌注山羊乳腺,采用Western blot在收集的乳汁中也检测到GP5-M蛋白的表达。结果证实,利用腺病毒载体作为基因转导的媒介,在山羊乳腺中可以表达GP5-M融合蛋白。     

传染性造血器官坏死症重组腺病毒载体的构建

【目的】克隆传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)G基因,构建其重组腺病毒载体,为IHN预防及疫苗的研制提供参考。【方法】通过RT-PCR和PCR技术扩增IHNV G基因,将G基因插入到腺病毒穿梭载体中,再用带有目的基因的腺病毒载体与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组,构建重组腺病毒质粒,通过PCR扩增及SalⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行包装,获得带有目的基因的重组腺病毒,通过观察绿色荧光蛋白表达情况来监控重组腺病毒,用Western-blot法检测糖蛋白的表达,并测定重组腺病毒的TCID_(50)。【结果】成功克隆出IHNVG基因,其长度为1 533bp。成功构建了IHNV G蛋白重组腺病毒载体。GFP监测显示,重组腺病毒转染成功。重组腺病毒能在HEK-293细胞中表达出分子质量约58ku的产物,与预期相符,其TCID_(50)达到1.0×10~(10.4)mL~(-1)。【结论】成功构建了带有IHNVG基因的重组腺病毒载体,重组腺病毒能高效表达,滴度较高。     

猪干扰素α和γ在杆状病毒中共表达及对PRRSV抑制作用

[目的]制备复合型猪干扰素α和γ进行应用抗病毒研究.[方法]本研究应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码猪干扰素α和γ成熟蛋白基因插入供体质粒pFastBacDual,分别置于PH和P10启动子控制下,引入蜂素信号肽(honeybee melittin signal peptide,HBM)基因取代猪干扰素α和γ原有信号肽基因以实现分泌型表达,并在C端分别融合6个组氨酸标签以利于纯化.将构建质粒转化DH10感受态细胞进行同源重组,获得重组穿梭质粒Bacmid,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒.重组杆状病毒感染昆虫细胞,鉴定重组蛋白的活性.[结果]通过问接免疫荧光、Western-blot证明猪干扰素α和γ重组蛋白在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中均获得表达,表达产物主要分布在培养上清中.通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性,结果表明:昆虫细胞上清的抗病毒效价达到3.24×10<'7>U·mL<'-1>.在Marc-145细胞,昆虫细胞上清经2<'-11>稀释能够抑制100个TCID<,50>的PRRSV的致细胞病变作用.[结论]应用杆状病毒表达系统实现猪干扰素α和γ在昆虫细胞上分泌共表达,重组蛋白在细胞上对PRRSV具有抑制作用.     

PRRSV细胞受体CD163 SRCR5-SRCR6多克隆抗体的制备

【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增出PRRSV甘肃株的核衣壳蛋白(N)基因,将N基因克隆至pGEM-T easy载体上,获得含N基因的阳性重组质粒pGEM-T easy-N.对质粒中的插入片段进行测序,应用DNAStar分析所测序列与GenBank中已登录的PRRSV毒株的同源性,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达载体pGEX-4T-1-N,转化E.coliBL21(DE3)细胞,用SDS-PAGE检测表达产物,并对其进行纯化.结果表明:PRRSV甘肃株N基因核甘酸序列与PRRSV-VR2332株的同源性为93.3%,与欧洲LV株的同源性为66.1%;构建的重组表达载体在大肠杆菌中获得了成功表达,表达产物为40ku的可溶性融合蛋白.     

鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igλ轻链基因中,并将鸡Igλ轻链信号肽与Pegfp-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp-C1-SP。鸡Igλ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点,构建了带有信号肽的鸡Igλ轻链/GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察,重组鸡Igλ轻链/GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达,而载体pEGFP-C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明,牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。     

埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基融合蛋白的真核表达与纯化

埃博拉病毒糖蛋白与病毒黏附、入侵宿主细胞等过程密切相关,为了更好地研究该糖蛋白与宿主细胞的相互作用,拟通过哺乳动物细胞表达系统,构建GP1亚基Fc标签融合蛋白。经鉴定,成功构建了埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达载体pFUSE-GP1-hIgG1-Fc2,并利用该载体及293T细胞构建了表达GP1亚基融合蛋白的哺乳动物细胞系。该融合蛋白N端带有IL2分泌信号肽,C端带有人IgG1-Fc2标签,可在293T细胞以分泌表达的方式存在于细胞培养上清中,而后利用Protein A亲和层析进行融合蛋白纯化。经Western Blots鉴定,成功制备GP1-Fc融合蛋白。这不仅为埃博拉病毒糖蛋白的研究提供了技术支撑,也为其他种类蛋白的哺乳动物细胞真核表达纯化提供了新思路。     

鸡Igγ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igγ轻链基因中，并将鸡Igγ轻链信号肽与Pegfp—C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp—C1-SP。鸡Igγ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点，构建了带有信号肽的鸡Igγ轻链／GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后，荧光显微镜观察，重组鸡Igγ轻链／GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达，而载体pEGFP—C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明，牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332 株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a( )上,构建原核表达载体pET-ORF6.阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSV ORF6基因获得表达.以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体.经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应.兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础.     

埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基融合蛋白的真核表达与纯化

埃博拉病毒糖蛋白与病毒黏附、入侵宿主细胞等过程密切相关,为了更好地研究该糖蛋白与宿主细胞的相互作用,拟通过哺乳动物细胞表达系统,构建GP1亚基Fc标签融合蛋白。经鉴定,成功构建了埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达载体pFUSE-GP1-hIgG1-Fc2,并利用该载体及293T细胞构建了表达GP1亚基融合蛋白的哺乳动物细胞系。该融合蛋白N端带有IL2分泌信号肽,C端带有人IgG1-Fc2标签,可在293T细胞以分泌表达的方式存在于细胞培养上清中,而后利用Protein A亲和层析进行融合蛋白纯化。经Western Blots鉴定,成功制备GP1-Fc融合蛋白。本研究不仅为埃博拉病毒糖蛋白的研究提供了技术支撑,也为其它种类蛋白的哺乳动物细胞真核表达纯化提供了新思路。     

E2蛋白介导猪瘟病毒的细胞吸附与内化

【目的】已有研究显示,猪瘟病毒(CSFV)通过网格蛋白介导的内吞作用侵入宿主细胞,然而参与侵入过程的病毒蛋白尚待阐明。研究旨在明确E2蛋白在CSFV侵入过程中的作用。【方法】通过瞬时转染包装携带E2基因的慢病毒,将慢病毒转导悬浮293细胞构建稳定表达重组E2蛋白的悬浮293细胞系,利用亲和层析的方法纯化重组E2蛋白,同时优化表达时间以增加蛋白产量。利用SDS-PAGE和Western blotting分别鉴定了重组E2蛋白的表达水平及其反应原性。通过感染试验、吸附试验以及内化试验分别探究了E2蛋白对CSFV感染、吸附以及内化的影响。将重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过阻断ELISA检测血清中多克隆抗体的阻断率。利用制备的多克隆抗体与CSFV感作后进行吸附和内化试验,进一步探究了E2蛋白在介导CSFV吸附和内化中的作用。【结果】通过倒置荧光显微镜观察转导慢病毒后的细胞系,与对照细胞相比可见明显的绿色荧光,表明慢病毒成功转导悬浮293细胞。SDS-PAGE结果显示,在还原和非还原条件下均出现与预期大小相符的蛋白条带,经Western blotting验证,上清中表达的重组E2蛋白能够被抗E2蛋白单克隆抗体WH303所识别,表明构建的悬浮293细胞系能够表达重组E2蛋白。通过优化表达条件,悬浮293细胞培养第8天时上清中重组E2蛋白浓度最高可达5.84μg·m L-1。可溶性蛋白阻断试验结果显示,重组E2蛋白具有阻断CSFV感染的活性。利用重组E2蛋白在病毒入侵过程中处理细胞对CSFV的感染同样具有显著抑制作用;阻断ELISA和中和试验结果显示,针对E2蛋白的多克隆抗体能够阻断CSFV感染,且具有良好的中和活性;吸附试验和内化试验证明,重组E2蛋白处理细胞能够显著抑制CSFV的内化,而利用多克隆抗体与CSFV感作后能够显著抑制其吸附。【结论】E2蛋白参与CSFV吸附和内化。