猪繁殖与呼吸综合征病毒NJ-a株ORF6基因的表达及特异性抗体的制备

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332 株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a( )上,构建原核表达载体pET-ORF6.阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSV ORF6基因获得表达.以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体.经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应.兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础.     

禽腺病毒4型SD2015株对SPF鸡的致病性研究

2015年从临床发病肉鸡鸡群中分离到1株禽腺病毒,经PCR鉴定及同源性比对确定为血清Ⅰ群4型禽腺病毒,对其肝组织毒及适应SPF鸡胚与鸡胚肝细胞的细胞毒进行致病性研究。结果显示:肝组织毒毒力最强且传代稳定;肝组织毒经肌肉注射途径攻毒,试验鸡发病率及死亡率略高于皮下注射而远高于口服感染途径;随攻毒鸡日龄的增长,其对腺病毒的感染力下降;肝组织毒攻毒量为108.0TCID50/只,可引起攻毒鸡8/10以上死亡,10/10感染,感染鸡剖检有典型的心包积水、肝脏肿大、肾脏肿大等病变。本试验结果对Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗免疫效力评价具有重要意义。     

山东省某地区肉鸡H9亚型禽流感与大肠杆菌混合感染的诊治

对山东某地连片家禽专业养殖户送检的病死鸡进行流行病学调查;通过实验室病理解剖、细菌分离和药敏试验、鸡胚接种、血凝价测定、特异性检测、分子生物学鉴定等诊断手段,确诊临床主要表现呼吸道症状、拉稀、减食、精神萎顿的病死鸡为H9亚型禽流感与大肠杆菌混合感染。后建议对发病养鸡场进行彻底消毒,加强饲养管理;并在以后批次的肉鸡饲养中改变免疫程序,增加7日龄鸡群新城疫、H9亚型禽流感、传染性法氏囊三联灭活疫苗免疫,饲养鸡群没有再发生禽流感与其他疾病的混合感染,取得了良好的防控效果。     

VA5免疫增强剂对鸡新支流三联疫苗免疫效力及肉鸡生产性能的影响

将VA5复方免疫增强剂与市售鸡新城疫–传染性支气管炎–禽流感(H9亚型)三联油乳剂灭活疫苗(以下简称“新支流三联疫苗”)合用免疫黄羽肉鸡，检测免疫后肉鸡的抗体效价、细胞因子及生产性能变化，评价VA5对鸡新支流三联疫苗的免疫增强作用及对肉鸡生产性能的影响。结果表明：黄羽肉鸡免疫含VA5的新支流三联疫苗后，在相同免疫剂量和免疫时间，血清和支气管肺泡冲洗液中针对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和H9亚型禽流感病毒(AIV(H9))的血凝抑制(HI)抗体效价均显著高于无VA5疫苗组的；泪液及小肠黏液中针对NDV、IBV和AIV(H9)的IgA抗体效价均高于无VA5疫苗组的；血清中IFN–γ和IL–4质量浓度均极显著高于无VA5疫苗组的；肉鸡出栏前，免疫含VA5的新支流三联疫苗组针对NDV和AIV(H9)的HI抗体合格率高于无VA5疫苗组的；添加VA5，提高了肉鸡平均成活率和上市率，同时降低了平均料肉比、呼吸道致病发病率和死淘率，增加了鸡只均质量，只均综合经济效益增幅达11.67%。综上所述，VA5免疫增强剂能提高新支流三联疫苗对黄羽肉鸡的免疫效力，同时提高了生产性能。     

山东省猪日本脑炎流行病学调查

应用日本脑炎病毒(JEV)间接ELISA检测试剂盒,对所收集的山东省不同地区在2003~2007年间的2459份血清样本进行JEV抗体检测,并对不同地区、不同年龄阶段以及不同年份的血清学结果数据进行统计学分析。结果显示,所有调查猪场全部都表现为JEV抗体阳性,猪场的阳性率为100%;对不同种类、不同年龄阶段的猪血清检测结果表明,种猪的血清阳性率为95.6%,保育猪的血清阳性率为94.5%,育肥猪的血清阳性率为92.0%。     

DF-DF-1细胞的保存期试验及致瘤性鉴定

为研究DF-1细胞的保存期及其传代过程中的稳定性和安全性,将来源于ATCC的DF-1细胞建立细胞库,取液氮保存12、24及48个月的DF-1细胞复苏,经3次传代后,观察不同批次细胞的生长特性并接种鸡传染性法氏囊病病毒,研究各批次细胞出现病变的时间及病毒含量;同时制备不同代次细胞的染色体并进行核型分析;对基础细胞库14代和最高代次60代的DF-1细胞进行致瘤性检测。结果显示,DF-1细胞在液氮中保存48个月,对细胞生长特征及增殖病毒无明显影响,经传60代后的细胞,染色体核型无明显差异且无致瘤性,表明DF-1细胞在传代过程中是稳定且安全的。     

鸡传染性法氏囊病毒蚀斑克隆纯化CV01株生物学特性研究

通过蚀斑克隆技术,对野外分离的鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)进行纯化后,筛选到1株病毒含量高、传代稳定的蚀斑纯化毒CV01株。生物学特性分析发现,IBDV能在鸡胚成纤维细胞(DF-1)上形成大小不同的蚀斑,且蚀斑大小与病毒的毒力有一定的相关性,大蚀斑的病毒含量高(108.0TCID50/m L以上),小蚀斑的病毒含量低(107.0l~108.0TCID50/m L)。蚀斑克隆VP2基因序列分析显示大蚀斑克隆毒具有IBDV超强毒株的特性。选病毒含量高(108.5TCID50/m L)的大蚀斑CV01进行进一步试验,结果发现CV01对10日龄SPF鸡胚的毒力达到106.7/0.2 m L以上,能致40%的30日龄SPF鸡感染。蚀斑克隆毒的免疫原性好,血清中和抗体水平高达15.6 log2,能100%抵抗超强毒株的攻击,表明该纯化株适合用于疫苗生产。     

嗜水气单胞菌转录调控蛋白基因(ahyR)突变株的构建及特性分析

根据GenBank公布的嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila,Ah)转录调控蛋白基因ahyR序列设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增AhJ-1株ahyR的部分片段。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经序列测定后定向连接入含有卡那霉素抗性(Kanr)基因的自杀性质粒pJP5603中,构建重组质粒pJP-ahyR。将鉴定为阳性的重组质粒转化嗜水气单胞菌J-1株感受态细胞,获得1突变株细菌。PCR方法鉴定该突变株为J-1株ahyR基因同源突变株,命名为J-1△ahyR。与J-1株相比,突变株的外膜蛋白图谱和部分生化特性发生改变;胞外蛋白酶、淀粉酶、DNA酶、溶血素等几种主要毒力因子同时丧失;致病力明显降低,对小白鼠的半数致死量大于1.0×108CFU(colonyformingunits)。该研究为ahyR基因功能的探讨及嗜水气单胞菌弱毒疫苗的研制奠定了基础。