野猪粪便中乳酸菌的分离鉴定及特性研究

【目的】筛选安全的、具有优良特性的乳酸菌菌株,进一步研发益生制剂,为饲料添加剂等动物相关产品提供资源。【方法】从我国黑龙江省大兴安岭地区采集野猪粪便样品13份,编号后置于4℃保温箱迅速运回实验室,利用MRS培养基分离纯化乳酸菌。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA,利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR鉴定,将扩增得到的序列测序后在NCBI上使用BLAST与GenBank数据库中序列进行对比分析,确定各菌株的分类学地位。将鉴定后的乳酸菌菌株分别接种于酸性（pH 3.0）和含胆盐（0.3%）的MRS培养基,在不同条件下评价乳酸菌菌株的耐酸、耐胆盐特性。将过夜培养的乳酸菌于室温条件下静置,在不同时间测定其OD_600nm,进行自凝集能力评价;过夜培养的菌株分别与致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌混合后于室温静置,进行共凝集能力检测。在体外,分别进行乳酸菌菌株对Caco-2细胞和IPEC-J2细胞的黏附能力测定,评价不同菌株的黏附能力。通过测定乳酸菌菌株对致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌的抑菌环直径,评价分离菌株的抑菌活性。通过体内外试验评价乳酸菌菌株的安全性。在体外,分别以模式菌株嗜酸乳杆菌和金黄色葡萄球菌作为阴性对照和阳性对照,将3株乳酸菌菌株和对照菌株在血平板上划线,37℃厌氧孵育18—24 h,观察细菌菌落周围是否形成溶菌环,评价分离菌株的溶血特性。使用文献中已报道的毒力因子引物对分离的乳酸菌菌株进行PCR扩增,检测是否存在毒力因子的编码基因,评估分离菌株的安全性。在体内,将过夜培养的乳酸菌连续饲喂7周龄的BALB/c小鼠21 d,分别测定小鼠的初始体重和最终体重,观察计算体重变化情况;饲喂21 d后,解剖获取小鼠的脾脏、肝脏和肾脏计算器官指数,评价分离乳酸菌菌株的体内安全性。【结果】从野猪粪便中分离得到3株对酸和胆盐具备一定耐受力的乳酸菌,经鉴定分别为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）、耐久肠球菌（Enterococcus durans）和黏膜乳杆菌（Lactobacillus mucosae）。3株乳酸菌菌株均表现出较强的自凝集能力和对致病菌的共凝集能力,同时对Caco-2细胞和IPEC-J2细胞均表现出较强的黏附能力,抑菌试验结果显示黏膜乳杆菌对3种致病菌均具备较强的抑菌活性。经体内外安全性评价,3株乳酸菌菌株无溶血性,且均未检测到毒力基因,经其连续饲喂的小鼠行为表现正常、状态良好,其中,与对照组相比,黏膜乳杆菌饲喂后小鼠增重显著。【结论】从大兴安岭野猪粪便中分离的3株乳酸菌（特别是黏膜乳杆菌）具有良好的特性和安全性,具备进一步开发益生菌制剂的潜力。     

猪瘟病毒衣壳蛋白与宿主丝/苏氨酸蛋白激酶N1相互作用的鉴定

为筛选并鉴定与猪瘟病毒(CSFV)衣壳(C)蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术以CSFV C蛋白为诱饵从猪外周血单个核细胞(PBMC)c DNA表达文库中筛选与之相互作用的宿主蛋白,共筛选到6种蛋白,分别为ATP5B、SON3、PKN1、PCBP1、RPS20和IQGAP1,根据Gene Ontology分析结果,这些蛋白分别参与细胞的增殖和代谢等过程。本研究选取丝/苏氨酸蛋白激酶N1(PKN1)进行进一步验证,经酵母共转化试验、免疫共沉淀试验和GST pull-down试验证实,宿主PKN1蛋白与CSFV C蛋白之间存在特异性结合。本研究首次证明PKN1与CSFV蛋白之间的相互作用关系,为进一步研究PKN1蛋白在CSFV感染过程中发挥的作用奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒双基因多组合DNA疫苗的构建

本实验根据PRRSV结构蛋白的特性和IFNγ及IL-2这两种细胞因子的特性,构建表达PRRSVGP4-GP5、GP5-M、GP5-N、GP5-IFNγ、GP5-IL-2、N-IFNγ、N-IL-2的重组质粒。这些重组质粒在真核细胞中得到了表达。用这些真核表达质粒可以免疫小猪,通过检测其对猪体免疫应答的诱导能力和接种后动物对PRRSV的抵抗力来对基因疫苗的效能进行研究,以期筛选到有效的基因疫苗并为今后进一步的研究提供思路和理论基础。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1a株ORF2～7序列测定

新近发现的猪生殖－呼吸道综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）是单股ＲＮＡ病毒，属于不久前成立的动脉炎病毒科。为了比较从国内分离的ＰＲＲＳＶ与欧美ＰＲＲＳＶ毒株的分子遗传学关系，本文扩增并克隆了ＰＲＲＳＶＣＨ－１ａ株ＯＲＦ２～７，测定了其核苷酸序列。用序列分析软件进行核苷酸和氨基酸序列比较分析，结果表明ＣＨ－１ａ株与欧洲型代表株ＬＶ的遗传关系较远，与北美洲型代表株ＶＲ－２３３２遗传距离最近，可能来自同一祖先。     

猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾

 猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20世纪50年代中国首创了举世闻名的猪瘟兔化弱毒疫苗（即C株），随后创制了不同的疫苗制造工艺，如细胞培养苗、乳兔组织苗和牛体反应组织苗等。C株是一株非常安全的弱毒疫苗，对各种年龄和品种的猪都没有副作用，并且有良好的免疫效力，它能同时诱导体液免疫和细胞免疫应答，对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。免疫母猪通过母乳可对仔猪提供被动免疫保护，但过高水平的母源抗体会影响仔猪对C株疫苗的主动免疫应答。目前已经完成了包括C株及其亲本株在内的几十株猪瘟病毒的全基因组序列测定和注释，建立了猪瘟病毒的反向遗传操作系统，初步解析了猪瘟病毒主要基因的结构与功能，并构建了不同的反向遗传操作标记疫苗，赋予了C株疫苗新的生命和内涵。C株疫苗可以用于猪瘟的控制和根除，借助于C株疫苗密集接种和综合控制措施，有关国家有效地控制了猪瘟，甚至消灭了猪瘟。尽管如此，要在全球范围内根除猪瘟，今后依然有漫长的路要走，这可能有赖于对C株进行进一步改造和利用。     

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

[目的]建立一种能区分猪瘟病毒（classical swine fever，CSFV）强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）检测方法。[方法]根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列，选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物，并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物，建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。[结果]应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段，但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0．04pg的CSFV RNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测，结果表明，有14份类似猪瘟强毒，1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。[结论]本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒，减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。     

应用酵母双杂交方法筛选与猪瘟病毒Npro蛋白相互作用的宿主蛋白

为研究猪瘟病毒(CSFV)与宿主细胞间的相互作用,本研究采用酵母双杂交方法以猪瘟病毒Npro蛋白为诱饵,从猪外周血单个核细胞(PBMC) cDNA表达文库中筛选与之相互作用的蛋白,经共转化试验表明,共筛选到12个与Npro蛋白相互作用的宿主蛋白,应用Cytoscape 2.8.2软件绘制了蛋白质间相互作用关系图,根据GO分析结果,这些蛋白分别参与细胞代谢、细胞生长、免疫等过程,经双分子荧光互补(BiFC)试验表明筛得的部分宿主蛋白与CSFV Npro具有相互作用.本研究中筛选得到的蛋白质对CSFV复制的影响有待进一步深入研究.     

腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2最早提供完全攻毒保护时间的研究

本实验室前期构建了腺病毒/甲病毒复制子嵌合载体猪瘟疫苗rAdV-SFV-E2,其免疫效力与商品化猪瘟C株疫苗相同,并具有鉴别检测特性.为进一步确定该嵌合载体猪瘟疫苗最早提供完全攻毒保护的时间,本研究将rAdV-SFV-E2免疫健康仔猪(n=5),免疫后于不同时间点采用猪瘟病毒(CSFV)强毒石门株进行攻毒,并检测其抗体应答、临床症状、病毒血症、病理学及组织病理学变化等.结果显示,rAdV-SFV-E2免疫后1周和2周,分别能对致死性CSFV强毒的攻击提供部分保护(3/5存活)和不完全保护(全部存活,但出现了短暂的发热和低水平的病毒血症);免疫后3周和4周,能够完全抵抗致死性CSFV强毒的攻击,表现为无病毒血症,无临床症状,无病理变化和组织病理学变化.该研究进一步证实rAdV-SFV-E2能够作为一种新型猪瘟标记疫苗,在猪瘟的紧急防控中能够起到一定的作用.     

科学免疫距离我们有多远?

免疫是猪场一项重要的日常工作,是保证猪场正常生产的有力措施,所以免疫对养猪人来说都非常熟悉。但就是这个非常普通的工作环节,却一直存在很多问题 。 猪病种类多,感染途径复杂,所以很多猪场使用疫苗十几种,小猪一出生就要各种疫苗的“辅佐”,并且跟随其一生,疫苗能有效地防止疫病发生,但是增加的应激也着实不少;因此产生一个极端反向观点,认为猪病太多了,我也不知道到底应该打哪些苗,如果都打,不但投资大,而且可能产生副作用,所以什么苗也不打;另外一部分猪场比较重视防疫,请兽医制订免疫程序,这其中有饲养管理各个方面措施到位的,生产平…