闽西地区猪流行性腹泻病毒M基因遗传进化及分子结构特征分析

为了解2015—2017年闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传进化规律,本研究收集了闽西地区12份PEDV阳性样品,对其M基因进行RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果表明,12株闽西毒株M基因氨基酸序列同源性为100.0%;遗传进化分析表明,12株闽西毒株与经典毒株CV777、2010年前中国分离毒株LCZ、以及韩国毒株SM98、virulent DR13的亲缘性较远,而与2010年后国内分离毒株以及2013年美国分离毒株亲缘关系最近,说明闽西PEDV毒株属于目前国内外流行毒株。分子结构特征分析表明,PEDV M基因具备高度保守的特性,可以作为设计疫苗的候选基因。     

水貂肠炎病毒NS1基因进化分析

采用PCR方法,从辽宁省、吉林省、山东省、河北省采集的32份样品中检测出21份水貂肠炎病毒感染阳性样品。每个地区选取有代表性的样品共计11份进行NS1基因的克隆和测序,并与已知参考毒株进行比对及系统发育分析。结果显示,本次检测的11个阳性样品的核苷酸序列和氨基酸序列同源性为98.8%~100.0%和98.5%~100%;本次测序序列和国内毒株MEVB基因的核苷酸和氨基酸序列同源性为98.7%~99.9%和98.7%~99.9%;与国外毒株MEVAbashiri基因的核苷酸和氨基酸序列同源性为99.0%~99.5%和98.7%~99.1%。11份阳性样品中水貂肠炎病毒的NS1基因有24个氨基酸位点存在变异。11份阳性样品可划分为3个分支。     

猪流行性腹泻病毒S2基因的克隆与遗传进化分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)新流行毒株的遗传变异情况,本研究对2014—2018年间采集的205份PEDV疑似阳性样品进行RT-PCR检测、扩增PEDV S2基因并进行遗传转化分析。RT-PCR结果显示,205份疑似阳性样品中有191份扩增出单一条带,片段大小为1 887 bp,符合S2基因的扩增预期。试验样品阳性检出率为93. 17%。测序分析表明,试验共获得25株S2基因序列,与参考毒株之间核苷酸的同源性为94. 3%～99. 6%,氨基酸的同源性为86. 4%～96. 2%。遗传进化分析结果显示,试验得到的PEDV毒株分属于G1、G2亚群。本研究为PEDV防控以及疫苗毒株筛选奠定基础。     

闽西地区猪流行性腹泻病毒N基因分子进化及序列分析

分析闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的遗传进化特征,收集闽西地区猪流性腹泻病例组织样品8份,用逆转录PCR(RT-PCR)扩增N基因,连接至pMD-18T载体进行测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果显示,8株闽西流行毒株之间N基因核苷酸的同源性为9.8%～100.0%,推导的氨基酸序列的同源性为99.5%～100.0%,而闽西毒株与早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性较远。氨基酸序列分析表明,闽西毒株氨基酸序列存在15处突变,与2010年后中国流行毒株变异位点相同。提示闽西地区毒株为目前国内流行毒株,与疫苗毒株亲缘关系较远,可能导致机体针对疫苗毒株产生的抗体不能够有效抵抗变异毒株,不能给猪群提供很好的免疫保护,因此需要基于变异毒株研究出有针对性的疫苗来预防PEDV。     

江西省猪伪狂犬病原流行病学调查及其gB、gE及TK基因遗传变异分析

为了解江西省猪伪狂犬病原流行情况及遗传变异情况,对2017—2018年收集的疑似伪狂犬样品,以1对针对猪伪狂犬病毒gE基因的检测引物进行病原检测,并随机挑选15株PRV阳性样品,对PRV病毒复制必需的糖蛋白gB基因和主要毒力基因gE与TK基因克隆测序及遗传进化分析,用以探究其遗传变异关系。临床结果显示:猪伪狂犬病毒检出率由2017年的4.76%PRV gB/gE/TK全基因序列遗传进化分析结果表明:调查的15株伪狂犬病毒毒株与中国株处于同一分支,与美国株Bartha差异较大。核苷酸同源性分析结果表明:15株PRV gB基因相互间同源性为98.9%～100%;与参考毒株的gB基因的同源性96.7%～100%;gE基因相互间同源性为99.1%～100%;与参考毒株的gE基因的同源性98.1%～100%;TK基因变异相对较小,相互间同源性为100%,与参考PRV毒株的gE基因的同源性99.1%～100%。研究结果表明,gB基因和gE基因存在较多的变异,可能是当前流行毒株抗原变异及毒力增强从而使现有疫苗免疫保护力不佳的主要原因。     

四川省腹泻病猪的猪萨佩罗病毒检测及1B基因序列比较分析

为了解猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus, PSV)的流行及变异情况,采集2015-2016年四川地区12个县市34个猪场共计428份腹泻病料,采用QRT-PCR方法对PSV进行检测。结果显示:在428份病料中,共有114份为PSV阳性,阳性率为26.6%;所检测的34个猪场中,共有20个猪场显示PSV阳性,猪场阳性率为58.8%,表明PSV在四川地区普遍存在。此外,对来自不同县市共14份PSV阳性病料1B全基因进行PCR扩增,通过分子克隆,测序,再利用序列分析软件对四川部分地区猪萨佩罗病毒1B基因进行序列分析。结果表明,14条猪萨佩罗病毒1B基因核苷酸序列及推导出的氨基酸序列相似性分别为90.6%~100%和97.1%~100%。遗传进化分析显示,该研究获得的四川株与已知中国株分属于一个大的分支,说明我国猪萨佩罗病毒1B基因序列较为保守,没有发生大的基因变异。所有中国分离株与韩国株、德国株、英国株处在不同分支,又说明我国PSV的流行毒株可能存在独立进化。     

鸽圆环病毒Cap基因的克隆与进化分析

应用PCR方法对采集的144份血清样品进行鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)检测,随机选择6份阳性样品进行Cap基因的扩增、纯化,并克隆至pMD18-T载体.测序结果与已知参考毒株进行序列比对和系统进化分析.结果显示:PiCV阳性检出率为75％(108/144),说明PiCV的感染比较严重.自测的6株Cap基因核苷酸的同源性为74.0％～100.0％,与GenBank上登录的国内外14株的Cap基因的核苷酸同源性为72.1％～100.0％.通过进化树分析6株阳性样品分成两大分支:5株位于一大分支,亲缘关系较近;但HBLF株单独位于另外一大分支,与其它5株亲缘关系远.     

鸽圆环病毒Cap及Rep基因的克隆与进化分析

为了解新疆和田地区某规模化种鸽场鸽圆环病毒(Pigeon circovirus,PiCV)感染情况和潜在来源,本研究采集了200份鸽粪便和3份鸽病料样本,对其进行PiCV Cap及Rep基因的PCR扩增、序列测定与分析。研究结果表明,PiCV检出率为47. 29%(96/203)。测序毒株被命名为PiCV-XJ2018,其Cap基因与GF82/Guangdong/2014毒株核苷酸同源性为94. 98%,Rep基因与GF71/Guangdong/2014毒株核苷酸同源性为97. 17%。遗传进化分析结果显示,PiCV-XJ2018毒株与国内2014年检测的广东株及上海株亲缘关系较近。本研究将为本地区鸽圆环病毒的诊断与防控提供参考数据。     

2株兔出血症病毒全基因测定与遗传进化分析

对2株兔出血症病毒(RHDV)SCH04、Sch07进行全基因组序列测定,并进行同源性及遗传进化分析。按照病毒核酸组成,将病毒基因分7段进行RT-PCR扩增,将分段扩增产物分别克隆到p MD-19T载体进行测序,用DNAStar进行拼接,得到全基因组序列;参照Gen Bank上登陆的31株RHDV毒株全基因核苷酸序列、VP60基因核苷酸序列以及ORF2编码基因核苷酸序列对2株病毒进行同源性和遗传进化分析。结果显示,SCH04基因组全长7 439 bp,Sch07基因组全长7 438 bp,2株病毒全基因的核苷酸序列同源性为99.8%,与31株参考毒株全基因的核苷酸序列同源性为78.3%~97.0%;2株病毒的VP60基因核苷酸序列同源性为99.7%,ORF2编码基因核苷酸序列同源性为99.2%。进化树显示2株病毒同属于抗原变异株RHDVa(GI.1a)基因群,且亲缘关系最近。VP60基因核苷酸序列与ORF2编码基因核苷酸序列均可以作为RHDV遗传进化分析。     

一株新城疫病毒F基因的克隆及其遗传进化分析

从新乡市某养鸡场的疑似新城疫病鸡群中分离到1株新城疫病毒,并对该病毒分离株进行F基因的扩增、序列测定和遗传进化分析。结果表明,该新城疫病毒分离株的F基因全长为1 662 bp,F蛋白裂解位点区的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具备强毒株的特征;同源性分析表明,该新城疫病毒分离株与国内外流行的基因Ⅶ型强毒株之间的同源性较高,为87.5%～97.7%,其中与国内流行的基因Ⅶd型的参考毒株同源性最高,为95.4%～97.7%,而与现用疫苗株La Sota、Clone-30、B1、Mukteswar等同源性较低,84.2%～86.6%;系统进化树分析表明,该新城疫病毒分离株与基因Ⅶd型参考毒株FJ882014、FJ608335和GU227738处在同一个进化分支上,亲缘关系最近。     

陕甘地区猪PCV3流行毒株的检测

【目的】调查陕甘地区猪场PCV3流行情况,为进一步研究与防控PCV3奠定基础。【方法】根据GenBank中PCV3基因序列,设计并合成了1对引物,对96个猪场的96份混合样本进行PCV3检测,将阳性样品进行序列测定分析,同时对PCV3阳性样品进行6种常见猪群病毒病检测。【结果】检测出了PCV3阳性样品8份,阳性率为8.33%。其中7份样品与其他6种常见猪群病毒存在不同程度的混合感染现象,混合感染率87.5%。序列分析表明,陕甘地区猪场8株PCV3基因片段核苷酸同源性在98.3%～100%,与不同地域参考毒株的同源性在97.6%～100%。【结论】陕甘地区2015年样品中即存在PCV3感染,不同地区的PCV3基因同源性较高,遗传稳定;基因进化树显示不同地域PCV3毒株交叉分布,没有明显的地域特征。     

2014—2016 年广东省PRRSV GP5 基因遗传变异分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,采集了2014—2016年间广东地区46个猪场317份疑患PRRS的临床样品进行检测,并对阳性样品的GP5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,选出21株PRRSV GP5基因进行序列比对和遗传进化分析。结果表明:所分离的PRRSV均属于美洲株,21株PRRSV GP5基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为82.4%~98.7%和78.6%~98.5%,其中2株与美国NADC30分离株同属亚群Ⅲ,10株与近几年广东省内分离的PRRSV毒株QYYZ和GM2同属于亚群Ⅳ。PRRSV GP5基因的遗传进化分析结果表明,亚群Ⅲ和亚群Ⅳ是近几年在广东省内流行的新兴亚群,研究结果将为PRRSV疫苗的选择以及防控方案的制定提供参考。     

禽腺病毒4型河南株Hexon全基因的克隆及遗传进化分析

【目的】分析禽心包积水-包涵体肝炎综合征的主要病原禽腺病毒4型(FAV-4)在河南省的流行和遗传变异情况。【方法】对2015年8-10月送检的40份疑似FAV-4感染的病料进行PCR阳性检测,同时根据采集地区与宿主的差异性,选取7份FAV-4阳性样品进行了Hexon全基因的扩增、克隆、测序和遗传进化分析。【结果】通过扩增Hexon基因421bp的片段,成功建立了禽腺病毒4型的PCR检测方法;40份家禽肝脏样品中,PCR检测显示35份为FAV-4阳性,阳性率为87.5%;成功扩增了包含Hexon基因全序列的片段,长度为2 889bp;7株FAV-4河南株的Hexon基因与GenBank中的12株FAV-4参考毒株Hexon基因序列之间核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,与参考株相比存在碱基的插入、突变现象;FAV-4河南株Hexon全基因推导的氨基酸序列与参考株之间的同源性为98.2%~99.8%,且发生变化的位置集中在前段和中段。【结论】FAV-4河南株与印度分离株亲缘关系较近,但与韩国分离株亲缘关系相对较远。     

猪细小病毒1型河南流行毒株的遗传进化分析

【目的】监测河南省猪细小病毒1型(porcine parvovirus 1,PPV1)的变异情况。【方法】采集自河南省鹤壁市和安阳市初产母猪的流产胎儿阳性样品，利用PCR方法鉴定获得2株PPV1流行毒株，经过全基因组测序，分别命名为CH/HN-H/2021和CH/HN-3/2021。通过分析同源性和构建遗传进化树分析PPV1全基因组、NS1基因、VP2基因的变异情况，并且比对分析NS1蛋白和VP2蛋白的氨基酸变异情况及非编码区基因缺失情况。【结果】2条序列的核苷酸相似性为99.9%;与46株国内外PPV1流行毒株全基因组的核苷酸同源性为93.5%～99.9%;NS1基因核苷酸同源性为98.6%～99.9%,NS1蛋白氨基酸同源性为98.2%～99.9%;VP2基因核苷酸同源性为98.4%～99.9%,VP2蛋白氨基酸同源性为98.3%～99.9%,说明本研究鉴定的毒株呈现遗传进化稳定性。本研究鉴定株与湖南及吉林毒株亲缘关系最近，而与河南原有毒株亲缘关系较远。在对NS1蛋白与VP2蛋白的氨基酸变异分析中发现，NS1蛋白发生6处突变，VP2蛋白发生7处突变，均在经典突变位点范围内，符合PP...     

长沙9个犬细小病毒毒株的分离与鉴定

从感染犬细小病毒(CPV)的长沙病犬粪便中分离CPV,采用同步接毒方式,将病毒悬液接种到猫肾细胞(F81),经PCR鉴定,从10份阳性样品中分离到9株CPV,血凝试验显示9株CPV均能凝集猪红细胞,血凝价均超过了27。为进一步分析CPV长沙毒株的VP2分子生物学特征及抗原变异规律,对9个CPV毒株的VP2基因进行克隆、测序及序列分析,结果表明:CPV长沙毒株与全国及世界各地CPV毒株相比,其VP2基因序列同源性超过97%,其VP2基因推导的氨基酸序列同源性超过94%;其VP2基因推导的氨基酸序列有独特的变异,且有独特变异的毒株在基因进化树上处于同一个分支。     

猪诺如病毒巢式RT-PCR检测方法的建立与应用

为了解中国猪群中猪诺如病毒感染情况,本研究根据猪诺如病毒保守的RNA依赖性RNA多聚酶(RNA Dependent RNA Polymerase,RDRP)基因序列设计了一套巢式RT-PCR引物,用该引物从猪粪便样品中扩增出与预期目的产物大小一致的条带,经克隆、测序后获得的序列与GenB ank数据库序列比对,证明所扩增的序列属于猪诺如病毒,表明本研究成功建立了猪诺如病毒巢式RT-PCR检测方法。该检测方法具有高特异性和敏感性,应用该方法检测某猪场健康育肥猪粪便样品,阳性率为54.5%。通过RDRP基因进行核苷酸同源比对发现本文获得的猪诺如病毒Wuning 1株属于GII群诺如病毒,与美国猪诺如病毒毒株OH-QW101/03/US、中国猪诺如病毒毒株Norovirus pig/GII/Ch6/China/2009核苷酸序列同源性最近。值得注意的是猪诺如病毒Wuning1毒株与武汉人诺如病毒毒株E2120/CHN/2010核苷酸同源性高达77.1%,说明猪诺如病毒Wuning 1毒株与武汉人诺如病毒基因组上亲缘性较近。本研究成功建立了一种检测猪诺如病毒的巢式RT-PCR方法,并应用于临床猪粪便样品的检测,为猪诺如病毒的诊断与监测提供了可供借鉴的方法、为猪诺如病毒的进化、分子病毒学及与人诺如病毒关系的深入研究提供依据。     

广西部分地市高致病性猪繁殖与呼吸综合征的流行病学研究

参照GenBank中已发表的PRRSV的序列设计了1对特异性引物,从广西部分地市发病猪场送检的65份病料中,检出14株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。对14个出现阳性的扩增产物进行克隆、序列测定,基因序列全长均为427bp,与国内部分流行毒株核衣壳蛋白基因的同源性均为96.2%以上,14份阳性样品之间同源性为97.2%以上,证实扩增的产物为高致病性猪繁殖与呼吸综合征。遗传进化分析表明,广西流行毒株均属于一个亚群,与江西、广州流行毒株高度同源。     

2008-2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析(英文)

[目的]对来自2008～2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。[方法]利用RT-PCR方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的36份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。[结果]260份病料中共检测到118份PRRSV阳性样品,阳性率为45.4%。ORF5序列分析和系统进化树分析结果表明,本试验所获得的36株PRRSV毒株序列均属于北美型,与GenBank中高致病性PRRSV(HP-PRRSV)参考毒株的氨基酸同源性为94.6%～100%,并可分为5个亚群,亚群III与HP-PRRSV同源性最高,几乎所有的亚群中和表位(primaryn eutralizing epitope,PNE)都存在变异,亚群III和IV相对于其它亚群具有更多的糖基化位点。由于36个毒株是于2008～2010年间采集自安徽、江苏、上海等7省,进化树分析结果表明,病毒的分型并没有呈现明显的地域性。[结论]2008-2010年间中国华东地区普遍存在PRRSV感染,PRRSV流行株为HP-PRRSV,其遗传演化相对稳定,但也具有不同的遗传特征。来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,虽然亚群IV和V只出现在部分省市,但PRRSV的分布没有呈现明显的地域特征。     

羊痘病毒江苏株P32基因的克隆与序列分析

根据GenBank中羊痘病毒基因(CPV)的核苷酸序列,设计了1对特异性检测引物。采用此引物检测来自于江苏丹阳的24份发病羊的皮肤痂皮。参考已发表的P32全基因的特异性引物,随机选择4份阳性DNA进行P32片段的扩增。将扩增产物纯化后连接pMD18-T载体,转化DH5α大肠埃希氏菌,选择阳性克隆送基因公司测序。应用DNAStar等分子生物学软件,对所测P32序列与GenBank中的国内外CPV毒株进行了同源性比较和遗传进化树分析。结果发现,24份疑似病料检测全是阳性;4个P32基因扩增产物均为1 023 bp,且样品间P32基因的核苷酸同源性为100%,与GenBank上已发表的的P32基因序列的相似性为97.7%~100%,且中国分离株在进化上属于同一分支。     

广西猪伪狂犬病的流行监测及防控工作重点

为调查猪伪狂犬病（PR）目前在广西的流行情况,于2006～2008年对广西13个市122个不同规模猪场进行流行病学调查,并对163份病料及61份血清进行检测。结果显示,163份病料经PCR检测出阳性病料6份,阳性率为3．7％;对6株广西PRV gE胞外基因进行克隆测序比较及遗传进化分析发现,广西PRV毒株变异不大,6株广西PRVgE基因与国内外其他毒株之间核苷酸序列同源性均很高,介于96．4％～100．0％之间,氨基酸同源性为93．6％～100．0％,亲缘关系较为密切,应为同一毒株遗传进化而来;61份血清经gE—ELISA检测出阳性血清7份,阳性率11．5％,表明部分猪场存在PRV隐眭感染。调查结果肯定了广西在PR防控工作中取得的成绩,提出做好免疫、加强监测、淘汰隐性感染猪、提高猪体免疫力、净化种猪群是今后PR防控工作的重点。