广西地区仔猪致病性大肠杆菌的菌毛基因多重PCR检测及质粒DNA指纹图谱分析

对广西地区56株仔猪致病性大肠杆菌进行菌毛基因的多重PCR检测及质粒DNA指纹图谱分析。多重PCR检测结果证实该方法可用于各大肠杆菌野生菌株的检测,且适用于仔猪大肠杆菌性腹泻病的快速诊断和流行病学调查。质粒DNA指纹图谱分析发现这56个菌株质粒的获得率为100%,来源相同的菌株具有相同或相似的质粒图谱,来源不同的菌株的质粒图谱一般不同。所有菌株都含有1条大小相同的质粒带,表明广西流行的猪大肠杆菌性腹泻病主要是由携带相同质粒的大肠杆菌引起。试验结果表明,质粒DNA指纹图谱法可作为大肠埃希氏菌分型的分子生物学方法。     

提高重组质粒转化E．coli DH5α方法的研究

研究了质粒载体和外源DNA的浓度、酶切体系的酶切时间以及酶切产物的链接时间对转化效率的影响。结果表明,当pUC19质粒载体的浓度为25ng/μL,外源基因λDNA的浓度为100ng/μL,酶切时间3h,且连接时间为14h时,构建出的重组质粒转化大肠杆菌DH5α效率最高。     

麝致病性大肠杆菌的质粒DNA分析

[目的]将麝致病性大肠杆菌从分子水平上分型,为麝大肠杆菌的分子流行学研究提供基础材料。[方法]采用Lysis Triton法对24株麝致病性大肠杆菌进行质粒抽提,并用HindⅢ、EcoRⅠ及BamHⅠ3种内切酶对质粒进行单酶切。[结果]质粒得率为91.6%,24株麝致病性大肠杆菌具有相同或相似的质粒图谱。[结论]质粒DNA分析为四川养麝场致病性大肠杆菌的分子流行病学提供了科学依据。     

四川省规模化猪场大肠杆菌质粒DNA分析

在系统鉴定、药敏试验和血清型鉴定的基础上,对23株致病性大肠杆菌和5株标准血清型大肠杆菌进行了质粒DNA分析.结果表明,菌株的质粒获得率为100%,来源相同的菌株具有相同或相似的质粒图谱,来源不同的菌株具有不同的质粒图谱.质粒图谱与血清型及耐药谱之间无明显关系.     

NaCl和PEG胁迫对金露梅种子萌发及幼苗的影响

为探讨NaCl、PEG处理对金露梅种子萌发和幼苗的影响,分别以0、40、80、120、160、200 mmol·L^-1浓度的NaCl溶液和0、100、125、150 、175、200、225、250、300 g·L^-1浓度的PEG溶液处理金露梅种子。结果表明,高于120 mmol·L^-1 NaCl溶液处理,对金露梅种子的萌发有明显抑制作用;40 mmol·L^-1的NaCl溶液抑制了金露梅幼苗生长。100～175 g·L^-1的PEG溶液处理金露梅种子,能促进种子萌发和幼苗胚根生长,而高于175 g·L^-1的PEG溶液处理,则对金露梅种子的萌发和幼苗生长具有明显的抑制作用。     

以潮霉素抗性为选择标记的毛壳霉原生质体转化

利用PEG方法，将含有潮霉素抗性标记的质粒pCB1003转化毛壳霉原生质体,并在高于毛壳霉敏感的潮霉素浓度下筛选转化子。转化率达1～2个转化子/μg质粒DNA。以潮霉素抗性的毛壳霉转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增及其产物的Southern杂交。结果表明，潮霉素抗性基因已整合入毛壳霉染色体。稳定性试验表明，所获得的转化子可通过有丝分裂稳定传代。     

(木奈)基因组DNA的提取与纯化

以(木奈)嫩芽为材料,对Dellaporta等用CTAB制备植物基因组DNA的方法进行改良,结果表明,加入质量分数ω=10% PVPP与材料充分研磨,将提取缓冲液的β-巯基乙醇体积分数降低为1%,能有效地去除材料中的多酚类物质;用氯仿/异戊醇(24∶ 1)抽提裂解液2次所获得的上相,加入1/10体积的65 ℃的NaCl/CTAB溶液混匀,再用氯仿/异戊醇(24∶ 1)连续抽提2次,并在DNA粗提液中加入适量高浓度NaCl和无水乙醇沉淀DNA,可以有效地去除多糖的干扰,获得比较纯净的DNA样品;PCR特异性扩增的结果表明,以改良法的DNA为模板可获得PPO基因保守区约600～800 bp特异条带,且扩增条带较亮、无引物二聚体出现.     

木芙蓉品种"单瓣红"种子萌发特性研究

为探究不同处理对木芙蓉品种"单瓣红"种子萌发的影响及其对干旱、盐碱胁迫的响应,采用机械损伤、浓硫酸浸种、赤霉素(GA_3)浸种及复合处理破除种子休眠,并采用不同浓度PEG6000和NaCl处理种子后测定种子发芽指标。结果表明:机械损伤15 min和浓硫酸浸种15 min处理组合对于打破种子休眠的效果最佳,种子萌发率达到90%以上;种子萌发与PEG6000和NaCl的胁迫浓度呈线性相关关系,种子发芽率、发芽势均随PEG6000和NaCl浓度增加而降低,在低浓度PEG6000和NaCl处理条件下,种子萌发指标与对照差异不显著,"单瓣红"种子能够在中度盐碱胁迫下萌发、生长,其对NaCl的中耐受浓度为6.7 g/L。     

氧化硅包裹的磁性纳米粒子抽提质粒DNA

质粒的分离纯化在分子生物学实际工作中占有重要地位,本文依据DNA在高盐条件下吸附于氧化硅介质,低盐条件下脱附的原理,采用包裹有氧化硅的磁性纳米粒子,粒径为20nm左右,在外磁场作用下提取细菌质粒DNA,操作简便,在20rain内完成．从1～3mL过夜培养的大肠杆菌LB培养液中可纯化得到1～30μg的高纯度质粒DNA,该质粒DNA可直接用于分子生物学下游操作．     

氧化硅包裹的磁性纳米粒子抽提质粒DNA

质粒的分离纯化在分子生物学实际工作中占有重要地位, 本文依据DNA在高盐条件下吸附于氧化硅介质, 低盐条件下脱附的原理, 采用包裹有氧化硅的磁性纳米粒子, 粒径为20 nm左右, 在外磁场作用下提取细菌质粒DNA, 操作简便, 在20 min内完成. 从1～3 mL过夜培养的大肠杆菌LB培养液中可纯化得到1～30 μg的高纯度质粒DNA, 该质粒DNA可直接用于分子生物学下游操作.     

耐盐基因HAL1的克隆及在原核细胞中的表达

以酵母基因组DNA为模板,采用PCR方法得到耐盐基因HAL1,插入原核表达载体pGEX-4T-1的XhoI和EcoRI酶切位点之间,构建原核表达载体pGEX-HAL1;将该载体转化到大肠杆菌中,重组菌株用IPTG诱导表达,其耐盐性比空白菌株提高50%;SDS-PAGE凝胶电泳结果显示有明显表达的蛋白质条带。     

变青链霉菌DNA的研究——Ⅰ.电泳过程中的特异性降解

变青链霉菌基因组DNA和质粒DNA在某些特定批号的电泳缓冲液中电泳时,双链DNA遭到很强的降解。变青链霉菌基因组DNA受到有限切割而产生的DNA片段的平均大小为6kb左右。天兰色链霉菌A3(2)和好几种其它链霉菌菌株的DNA,以及大肠杆菌的DNA在同样条件下并不受这种切割的影响。已经证明,这种特异性对变青链霉菌DNA的切割不是由于缓冲液中污染了微生物,进而产生核酸酶所致,而是由于某些批号的EDTA商品中污染了Fe~(2+)所致。变青链霉菌中DNA制备物“较差”的许多报道可能都是上述原因所致。     

一种改良的提取猫细小病毒基因重组质粒（pEH20）DNA方法

通过对碱变性和ＰＥＧ法提取纯化质粒ＤＮＡ的改进，成功地进行了ｐＥＨ２０ＤＮＡ的制备，得到了高纯度的质粒ＤＮＡ。改进的方法使碱变性法与ＰＥＧ法有机地衔接起来，具有经济、省时、简便、可靠的特点，可用于相关质粒ＤＮＡ的大量制备。     

牛胰腺核糖核酸酶A的基因克隆、表达及初步鉴定

【目的】为了避免在制备基因治疗或基因免疫的质粒时使用动物源性的核糖核酸酶A（RNase A）。【方法】提取牛胰腺总RNA，利用RT-PCR扩增出牛核糖核酸酶A cDNA，RT-PCR产物克隆到pGEM-T载体测序验证后，将此cDNA亚克隆到大肠杆菌分泌型表达载体pEZZ18中。【结果】SDS-PAGE电泳显示其转化菌经温度诱导后能表达预计的大小为28 kD重组蛋白。用渗透法释放出表达产物，将其加入到经碱裂解粗提的质粒DNA中并孵育0.5 h，琼脂糖凝胶结果表明表达产物能很好地去除细菌的RNA并且不降解超螺旋质粒DNA。【结论】在质粒的纯化过程中，重组牛核糖核酸酶可以替代动物源性的RNase A。     

磁性纳米颗粒在DNA分离纯化中的应用

为了解磁性纳米颗粒在DNA分离纯化中的应用，采用文献综述和归纳总结的方法，阐述了1997—2021年以铁氧化物为核心的磁性纳米材料的研究进展，同时比较了材料结构和表面相关活性官能团的修饰对DNA提取效率的影响。结果表明:1)应用磁性纳米颗粒的固相萃取有着安全无毒、操作简单、可重复使用、能够实现自动化与高通量操作等多种优势，提取DNA效率相比于商业化试剂盒也有优势。2)目前磁性纳米材料已有比较全面的研究。磁性纳米颗粒的尺寸、孔径大小、磁化强度及引入的活性官能团不同等性质均对DNA的提取效率有影响，改变这些性质研发新型且高效的功能化磁性纳米颗粒或改变磁性纳米材料的制备方法、所提取DNA的形态性质、溶液的pH或盐浓度等试验条件，以提高DNA与材料的解吸率，不断优化磁性分离过程，提高DNA分离效率和质量。3)发展高通量商业化的核酸提取程序，是磁性固相萃取可观的发展前景。4)磁性纳米颗粒除了在核酸提取中的应用，在其他生物医学应用中也有着广泛的研究。以上结果均表明磁性纳米材料有着极强的研究发展前景。     

甘蔗胁迫诱导表达基因ScCBF1的功能分析

以甘蔗苗为材料研究了甘蔗CBF1转录激活因子ScCBF1在水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)以及重金属镉(Cd Cl_2)和铜(Cu Cl_2)胁迫下的表达情况;将ScCBF1的原核表达载体p GEX-6P-1-ScCBF1转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3),检测其在NaCl、PEG8000胁迫下的生长情况.结果表明:ScCBF1在Me JA、SA、Cd Cl_2以及Cu Cl_2逆境胁迫下表达下调;在500 mmol·L-1NaCl胁迫下,含有重组质粒的细胞生长速度显著减缓,不同浓度NaCl胁迫下的平板胁迫结果进一步说明了ScCBF1基因不具耐盐性;在15%PEG8000胁迫下,含有重组质粒细胞的生长速度明显高于对照,不同浓度PEG8000胁迫下的平板胁迫结果说明了ScCBF1基因在应答干旱胁迫中具有抗逆性.构建了ScCBF1的植物表达载体p CAMBIA1301-ScCBF1并通过农杆菌侵染在本氏烟叶片中瞬时表达,在4℃低温胁迫下,T0代烟草植株长势显著优于对照.     

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPFG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达.     

PEI介导外源基因进入植物细胞的瞬时表达

 【目的】医学方面的大量研究证实,聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）作为一种新型阳离子多聚物基因载体可以吸附和浓缩DNA,通过与细胞膜亲和粘附和细胞吞噬作用运载外源基因进入细胞并实现表达。本实验研究旨在探索PEI作为非病毒基因载体介导外源基因进入植物细胞并获得瞬时表达的可能性。【方法】制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞分析PEI与DNA的结合情况,采用电子显微镜观察PEI/DNA复合物的形态。以绿色荧光蛋白基因为报告基因研究不同N/P比条件下PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率,并与PEG转化方法进行比较分析。【结果】PEI与DNA的质量比为5﹕1～1﹕4,PEI可以与DNA稳定结合,形成粒径约100～200 nm的球形复合物。PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率随其N/P比的增大而提高,N/P＝5时PEI的转化效率达到最高且明显高于PEG介导的转化效率,N/P＞5时转化效率反而下降,容易使细胞破碎和变形。【结论】PEI作为一种新型的外源基因运送载体对拟南芥原生质体细胞具有良好的介导基因转移效果。     

电穿孔法用于大肠杆菌和苏云金杆菌的转化及质粒消除

利用电脉冲将质粒pHT3101和pHE－4D分别转入了大肠杆菌和苏云金杆菌,结果显示大肠杆菌DNA的转化率（转化子）为104～105·μg－1,苏云金杆菌的DNA的转化率（转化子）为102～103·μg－1．同时利用该法消除了Escherichiacoli菌株TG1和Bt菌株ISP78／11中的pHT3101质粒,消除率分别为88．6％和66．4％．比较了转化和质粒消除的条件并构建了一个工程菌．     

基于磁珠的细菌基因组DNA快速提取方法

[目的]为临床上大肠杆菌O157∶H7的快速检测提供参考。[方法]依据高盐离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面可发生非特异性吸附,而蛋白、单糖、多糖和脂类等细胞成分不被吸附的原理,建立了一种以磁性微珠为载体的细菌基因组DNA纯化方法—磁性DNA纯化法。[结果]该方法可在7min内完成对大肠杆菌O157∶H7基因组DNA的高效富集与纯化;与德国进口同类试剂盒gene-MAG-DNA/Bacteria及AxyPrep细菌基因组DNA纯化试剂盒相比,该方法操作简单、耗时短、不需要使用离心机和有机试剂,且无需常规快速提取法的沸水浴等步骤,安全、快速、成本低,在临床、食品、环境病原体快速检测领域具有巨大的推广价值。[结论]该研究成功建立了一种细菌基因组DNA的快速提取方法。