变铅青链霉菌DNA的研究——Ⅱ.位点特异性降解与DNA修饰的关系

变铅青链霉菌的DNA上存在着一种异常的修饰,使其在含有微量Fe~(++)的缓冲液中电泳时,双链DNA遭到降解。DNA的切割是位点特异性的。与已知修饰特征的DNA进行同步试验发现,变铅青链霉菌的这种特异性修饰与目前所发现的修饰系统(如DNA甲基化)均不相同,很可能是一种新的修饰系统。     

抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

两种放线菌基因组DNA PCR模板制备方法的比较

[目的]比较制备放线菌基因组DNA PCR模板的两种方法液氮研磨法及TE煮沸法.[方法]以从河西走廊盐碱土壤中分离鉴定的8属16株菌为材料,包括糖丝菌属（Saccharothrix）Ⅳ23-3-4、类诺卡氏菌属（Nocardioides）Ⅴ22-5-1、原小单孢菌属（Promicromonospora）ⅨX5-4-3、小单孢菌属（Micromonospora）Ⅱ23-4-1、放线多孢菌属（Actinopolyspora）Ⅳ8-2-5、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）Ⅱ8-4-3、链单孢菌属（Streptomonospora）DA01305、链霉菌属金色类群DA03401、链霉菌属金色类群DA01408、链霉菌属蓝色类群DA09140、链霉菌属金色类群DA01308、链霉菌属灰红紫类群DA05213、链霉菌属蓝色类群DA11417、链霉菌属粉红孢类群DA04401、链霉菌属灰红紫类群DA04402、链霉菌属球孢类群DA04307.对两种方法制备的PCR模板进行16S rDNA的扩增,PCR产物进行电泳检测.[结果]两种方法均能得到比较清晰的目的条带,但TE煮沸法简化了放线菌基因组DNA PCR模板制备的过程,可用于高通量放线菌PCR模板的快速制备.[结论]该研究为大批量菌株的快速鉴别和系统分类提供了有效的方法.     

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。     

拮抗链霉菌AFLP分析技术体系的研究

[目的]探索基于AFLP的拮抗链霉菌DNA模板制备方法及其扩增体系,为AFLP技术在链霉菌乃至放线菌资源分析中的应用提供依据。[方法]以改进的CTAB法提取DNA,利用Pst I／Mse I型AFLP试剂盒及其反应体系进行扩增,采用5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增结果。[结果]提取了10个拮抗链霉菌菌株的基因组DNA,0.8％琼脂糖凝胶电泳检测显示其主带清晰,片段大小为37.64-40.86Kb,无降解现象,亦无RNA残留;其OD260/OD280为1.625-1.833;Pst I／Mse I双酶切产物琼脂糖电泳呈弥散荧光长带,说明酶解充分;筛选出的3对引物对DNA模板的扩增谱带清晰,多态性丰富。[结论]该研究建立的DNA模板制备方法及其扩增反应体系可用于链霉菌的AFLP分析。     

小白链霉菌武夷变种HWM DNA的制备及最适酶切条件确定

为构建小白链霉菌武夷变种(Streptomyces albulus var. wuyiensis)的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes,BAC)文库,提取了小白链霉菌武夷变种高分子量DNA(high molecular weight DNA,HMW-DNA)。用低熔点琼脂糖(low melting point agarose,LMP)包埋小白链霉菌武夷变种菌丝球,胶块经溶菌酶、蛋白酶K、两种限制性内切酶(BamHI、Hind III)处理后,使用箝位匀强电场(CHEF)凝胶电泳检测DNA片段大小。电泳结果显示提取HWM DNA完整,满足构建BAC文库的条件,确定了最适酶切条件为Hind III0.2 U酶切10min,为小白链霉菌武夷变种功能基因的研究奠定了基础。     

接合转移技术将外源DNA大片段引入变铅青链霉菌中的研究

为了发展一种将150 kb及以上的外源DNA片段引入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的有效方法,以大肠杆菌-变铅青链霉菌穿梭细菌人工染色体为载体,将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个150~180 kb的外源DNA片段期望以接合转移的方式从大肠杆菌宿主菌(Escherichia coli ET12567/p UZ8002)中横向转移入变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK23菌株中。结果表明,接合转移技术能够有效地将携带完整格尔德霉素生物合成基因簇的3个外源DNA大片段引入到变铅青链霉菌基因组中并稳定传代。     

生防链霉菌Men-myco-93-63nsdBmgh基因的克隆及序列分析

为了获得生防链霉菌Men-myco-93-63中nsdB基因,根据天蓝色链霉菌A3(2)负调控基因nsdB序列设计引物,扩增Men-myco-93-63基因组DNA,获得1 121 bp的片段,经NPA-PCR对其两端进行延伸,拼接后得到2 073 bp的全长序列,命名为nsd Bmgh.经Southern杂交验证,该...     

不同保存方法和研磨方式对玉米总DNA提取效果的影响

以玉米自交系昌7-2为材料,采用改良CTAB法提取基因组DNA,分析不同保存和研磨方法等对样品提取效果的影响。通过A260/A280、琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增,对提取的基因组DNA进行分析鉴定。结果表明,CTAB缓冲液保存叶片并在CTAB缓冲液中研磨叶片,得到的DNA效果最佳,同时这种方法也比较经济安全。     

重组谷氨酰胺转胺酶的表达、复性及纯化 

以吸水链霉菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到谷氨酰胺转胺酶基因片段,构建pGEX-TGase重组质粒,并转化到大肠杆菌中得到重组菌BL21/pGEX-TGase。重组菌经乳糖诱导产生融合蛋白,并对诱导条件进行了优化。表达产物主要以包涵体形式存在,采取稀释及尿素梯度液相色谱结合的方法,成功地实现了包涵体蛋白的复性。通过GST亲和柱纯化目的蛋白,得到酶活为29U/mg的电泳纯目的蛋白。     

一个链霉菌中微型转座子系统的构建

针对链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷,构建了一个链霉菌中的微型转座子质粒pHL265,它携带的转座酶基因tnpA在转座子mini-Tn4560A外部,降低了发生二次转座的可能性,并带有大肠杆菌与链霉菌进行属间接合转移的起始位点oriT,可通过接合转移的方式将其从大肠杆菌导入到链霉菌中.利用该转座子系统转座筛选得到天蓝色链霉菌M145的约1 000株转座突变株.选取其中的8株,经Southern杂交验证可知,该转座子的转座基本具有随机性,并在宿主DNA中稳定存在.此系统为链霉菌功能基因组的研究提供了新的技术手段.     

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中3个调控基因的检测

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63及其发酵液对多种重要植物病原菌均表现出很强的抑制作用,在植物病害生物防治方面有很大的应用潜力。根据天蓝色链霉菌A3(2)调控基因tcrA、sarA和scrX序列设计引物,扩增Men-myco-93-63基因组DNA,分别获得705bp、1 472bp和473bp的片段,经测序和比对,上述片段与天蓝色链霉菌A3(2)的tcrA、sarA和scrX基因在核苷酸序列和氨基酸序列上同源性均为99%,因此,推测玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中很可能含有这些调控基因。Men-myco-93-63中这3个调控基因的初步检测为玫瑰黄链霉菌功能基因的获得、菌株的遗传改良和代谢调控途径的研究提供了重要依据。     

链霉菌SH-62中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达

通过生物信息学分析,在链霉菌SH-62的基因组中发现一个Ⅱ型聚酮合酶基因簇(ents),与已报道的来源于Streptomyces maritimus的肠菌素生物合成基因簇具有高度的相似性。通过构建和筛选链霉菌SH-62的基因组细菌人工染色体(BAC)文库,克隆得到完整的ents基因簇。将ents基因簇导入白色链霉菌中进行异源表达,HPLC和LC-MS分析结果表明该基因簇负责肠菌素的生物合成,从而证实了ents基因簇的生物学功能。     

利用基因组发掘技术指导链霉菌SH-62中活性天然产物的分离及鉴定

通过生物信息学分析,利用基因组发掘技术发现链霉菌SH-62基因组中至少含有37个次级代谢产物的生物合成基因簇,除了有4个基因簇分别与已知的肠道菌素、潮霉素A、尼日利亚菌素和格尔德霉素的生物合成基因簇具有高度同源性以外,其他基因簇的功能鲜见报道。在不同发酵培养基上培养链霉菌SH-62,利用高分辨率的LC-MS对发酵产物进行分析,发现链霉菌SH-62确实能够产生肠道菌素、潮霉素A和尼日利亚菌素,从而证明了基因组发掘策略确实能够指导代谢产物的分离及鉴定。     

鸡血藤DNA提取方法的研究

[目的]筛选一种适合鸡血藤DNA的提取方法。[方法]以鸡血藤嫩叶为材料,分别采用液氮-CTAB法、石英砂-CTAB法以及石英砂-SDS法提取基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取的DNA样品,对提取方法进行比较筛选。[结果]电泳检测中,石英砂-CTAB法所提DNA条带亮度最高,质量较好。紫外检测中,石英砂-CTAB法提取的DNA A260/A280值大于1.8,比其他两种方法提取的DNA蛋白质污染小,其提取的DNA纯度和得率均最高,液氮-CTAB法提取DNA得率居中,石英砂-SDS法提取DNA得率较低。[结论]该研究结果表明石英砂比液氮更能简便快速地将叶片研碎,CTAB提取缓冲液比SDS提取缓冲液可更有效地去除杂质,使细胞裂解、DNA析出。因此,石英砂-CTAB法更适合鸡血藤DNA的提取。     

链霉菌YH 9407菌株的化学分类研究

在形态学分类的基础上,从细胞壁组分的氨基酸组成、糖的类型、蛋白质和同功酶谱等方面对农用抗生素TS 99产生菌YH 9407菌株的分类地位进行了探讨.结果表明,链霉菌YH 9407菌株与对照菌株杀真菌链霉菌G.4.1312的细胞壁氨基酸组成、全细胞糖型相同,均为氨基酸Ⅰ型细胞壁,糖型C;YH 9407与对照菌株在对数生长期时的蛋白质电泳谱带完全一致.在测定的6种同功酶谱带中,PAL(Phenylalanine ammonia lyase)有2条带的差别,POD(Peroxidase)只有1条带的差别,SOD(Superoxide dismutase),CAT(Catalase),PPO(Polyphenol oxidase)以及淀粉酶(Amylase)的谱带完全相同.说明链霉菌YH 9407与对照菌株杀真菌链霉菌G.4.1312在分类地位上相近,可归为同一类群.     

稀有放线菌小单孢菌噬菌体ΦHAU8基因组文库的构建

利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pHZ1358作为载体,构建了小单孢菌噬菌体ΦHAU8的基因组文库,文库质粒酶切结果表明,噬菌体ΦHAU8基因文库中的质粒DNA是由载体pHZ1358和噬菌体基因组片段组成的.     

链丝菌素生物合成基因簇的克隆及其异源表达

通过基因组粘粒文库的高通量接合转移、异源表达和生物活性测定,结合DNA序列测定,从刺孢吸水链霉菌AA97026中筛选具有广谱抗菌活性的小分子化合物及其生物合成基因簇,获得1个对革兰氏阳性细菌和红酵母均有抑制活性的阳性克隆1H5,其部分DNA序列与链丝菌素生物合成基因相似。含1H5的异源链霉菌宿主的发酵液均能检测到链丝菌素的不同组份,表明1H5含有完整的链丝菌素生物合成基因簇。     

4种高梁基因组DNA快速提取方法的比较

[目的]寻找快速、简单、成本低的高粱基因组DNA提取方法。[方法]首先,分别使用液氮研磨法、缓冲液研磨法、烘干研磨法和直接研磨法这4种方法从高粱叶片中提取基因组DNA,然后,通过凝胶电泳、SSR分析和SRAP分析检测所提DNA的浓度和纯度。[结果]采用4种方法提取高粱基因组DNA时的产量相差不大;采用前2种方法提取的DNA降解少、纯度高,可进行有效的SRAP-PCR和SSR-PCR,但缓冲液研磨法的SRAP-PCR结果稍差;而采用后2种方法提取的DNA降解严重、纯度低,但可进行有效的SSR-PCR。[结论]采用4种方法均可在短时间内提取到足够几十次PCR反应的高粱基因组DNA,液氮研磨法和缓冲液研磨法所提取的DNA应用范围更大,而烘干研磨法和直接研磨法所提取的DNA只能用于对片段较小的目的DNA进行特异性PCR。     

适于SSR-PCR的农作物基因组总DNA高通量提取方法的建立

[目的]建立一种新的、通用、快速的农作物基因组总DNA提取方法,为应用分子标记技术研究遗传多样性及变异提供方便.[方法]分别从甘蔗、水稻、玉米、花生和大豆5种作物中提取基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA质量进行检测,然后每种作物分别选取两对SSR引物进行PCR扩增,用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果.[结果]采用该提取方法,不同作物产生的纯DNA在100.0~160.0 g/g,提取DNA的A260/A280比率在1.80~1.95.此外,电泳凝胶未出现可见的RNA污染,每个作物基因组DNA单一条带非常清晰,DNA结构完整,质量较高,适用于分子标记的研究.应用SSR分子标记进行PCR扩增,重复性、稳定性好,经琼脂糖凝胶电泳检测,条带清晰且分辨率较高.[结论]建立的DNA提取方法为直接将叶片剪碎后装入EP管中,加入提取缓冲液进行DNA提取,省去了用液氮研磨的过程.与传统的DNA分离方法相比,新建立的DNA提取方法具有高通量、简单、快速、经济效益高等优点.