苏云金芽孢杆菌8010蛋白酶基因保守区克隆及序列分析

通过设计蛋白酶基因引物,对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)库斯塔克亚种菌株8010蛋白酶基因进行克隆,获得了6个蛋白酶基因片段,即中性蛋白酶A、色氨酸合成酶β链、色氨酸合成酶α链、碱性蛋白酶A、磷酸化水解酶和糖原磷酸化酶基因,以及1个未知功能的DNA片段(可能是编码蜡质芽孢杆菌组特有蛋白的基因).     

苏云金芽胞杆菌不同分化发育时期总RNA的有效分离

将苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）8010在LB液体培养基30℃、230r／min下振荡培养,通过生长曲线测定（OD600）和显微镜观察,分别在8、30、39、42h和46h取样得到营养生长期、孢子囊期和裂解期样品来提取总RNA。通过对试剂提取方法的改进,找到一种方法可以很有效的提取Bt3个不同分化发育时期（营养生长期、孢子囊期和裂解期）的总RNA。提取的总RNA质量很好,可以进行cDNA合成、RT-PCR和转录组学研究等下游实验。     

大肠杆菌中的表达

 在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）cry2Ac4基因；笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板，利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因，进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接；成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109，从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4，再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，经IPTG诱导后，对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测；cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

基于转座子突变获得苏云金芽胞杆菌解毒Cr(Ⅵ)的相关基因功能分析

为了获得苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)解毒Cr(Ⅵ)的相关基因并进行功能分析,从Bt407转座子随机突变体库筛选并获得了9株Cr(Ⅵ)还原能力突变株,测定了其转座子插入位点,并研究了表型变化。这些突变株的Cr(Ⅵ)还原能力比野生株极显著提高(p0.01),其转座子插入位点均为编码假定的肽链内切酶yddH基因。研究结果表明,野生株与突变株的生长曲线没有显著差异,说明突变株Cr(Ⅵ)还原能力的极显著提高与菌种数量改变无关。突变株总铬含量基本保持不变,表明Bt 407主要是通过将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)来解毒Cr(Ⅵ)。本研究为构建高效解毒Cr(Ⅵ)工程菌提供了新候选基因材料。     

枯草芽孢杆菌新抗病基因aiiA的克隆

枯草芽孢杆菌内生亚种BS-1aiiA基因测序结果表明,该基因(GenBank登录号DQ000640)由753个碱基组成,其编码的蛋白质含有250个氨基酸残基,与10个已报道的具有减弱欧文氏菌胡萝卜亚种致病力的AiiA蛋白酶氨基酸序列总的相似性为82%.它们均含有相同的氨基酸序列保守区.Signal P分析结果显示,BS-1 AiiA没有信号肽序列,并利用Swiss-model预测、分析了BS-1 AiiA蛋白的三维结构.     

苏云金芽胞杆菌酰基高丝氨酸内酯酶基因的克隆及分析

利用pMD18-T克隆载体从苏云金芽胞杆菌菌株WB12中克隆了酰基高丝氨酸内酯酶基因(AHL-lactonase,aiiA).测序结果表明,该基因(GenBank登录号为DQ000642)由753个碱基组成,编码含有250个氨基酸残基的蛋白质.推测该蛋白质分子质量为28 ku,等电点为4.2,不含信号肽序列.利用DNAMAN软件构建同源关系树.结果表明,该蛋白与已报道具有减弱欧文氏菌胡萝卜亚种致病力的11个A iiA蛋白酶氨基酸序列总相似性为81.2%,并含有相同的氨基酸序列保守区.核苷酸序列的BLAST分析结果表明,与之同源性较高的基因均为蜡质芽孢杆菌组aiiA基因(86%-99%).     

应用多元PCR鉴定水体中大肠杆菌的毒素基因

根据已发表的大肠杆菌毒素基因序列,针对大肠杆菌的8种毒素基因设计特异引物并进行多元PCR扩增,验证多元PCR技术的可靠性及其在水环境中大肠杆菌毒素基因检测的实用性。     

苏云金芽胞杆菌cry2Ac4基因在 大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)cry2Ac4基因;笔者以含有BtWB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPFG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达.     

虫生真菌座壳孢代谢产物杀虫活性

从采自福建建瓯柑橘园的粉虱虫尸上分离纯化获得一株座壳孢Jos009,经液体和固体发酵培养,分别提取得到不同的代谢产物,并将其用于对桃蚜、温室白粉虱和棉铃虫3种常见害虫的防治效果研究.结果表明,该菌株液体发酵的胞外代谢产物Ⅱ对桃蚜有很强的触杀毒性,24和48h的LC50分别为1.047和0.708mg.mL-1,而该菌株代谢产物对温室白粉虱和棉铃虫无毒杀作用.本试验还发现不同的培养方式对该菌代谢产物的生物活性有很大影响,液体发酵比固体发酵更有利于其杀虫活性物质的产生.     

大肠杆菌中的表达

 在大肠杆菌中表达苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）cry2Ac4基因;笔者以含有Bt WB9菌株cry2Ac4基因的质粒pMD2Ac为模板,利用cry2Ac4基因的特异引物对(ET-F/ET-R)扩增获得该基因,进而将cry2Ac4基因与pET-29a原核表达载体连接;成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌JM109,从阳性转化子中提取重组表达质粒pET-29a-cry2Ac4,再转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,经IPTG诱导后,对诱导表达产物进行了SDS-PAGE检测;cry2Ac4基因编码的约70kDa蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。