冷胁迫下不结球白菜BcSLAC1基因克隆和表达分析 及ABA和H202在调控气孔运动中的作用

采用RT-PCR方法首次获得不结球白菜BcSLAC1基因,该基因核甘酸序列全长l 668 bp,其开放阅读框编码555个氨基酸.与已公布的拟南芥SLAC1基因有较高的同源性.系统进化树分析表明:与SLAHs基因家族其他基因相比,BcSLAC1基因与拟南芥SLAC1基因有更近的遗传距离.在冷胁迫条件下利用气孔开张度测量和荧光显微技术分析表明:冷胁迫下H2O2可能作为下游信号分子参与了保卫细胞中ABA信号转导.实时定量RT-PCR检测表明,冷胁迫下BcSLAC1基因表达量升高,同时用ABA处理后,BcSLAC1基因表达量比抗坏血酸处理后明显上升,说明ABA对BcSLAC1基因的诱导作用和ABA诱导产生的H2O2有关.     

水分胁迫诱导的玉米叶片钙调素基因表达及其与ABA和H_2O_2的关系

以玉米(Zea mays L.)为材料,探讨了水分胁迫下玉米钙调素(CaM)基因CaM1、CaM2和CaM3在叶片中转录水平的变化;并对水分胁迫下脱落酸(ABA)积累和H2O2产生与CaM基因表达的关系进行了研究.结果表明,25% PEG 6000模拟的水分胁迫能够诱导上述玉米CaM基因在叶中的表达,其中对CaM1和CaM3的影响较为显著,3个基因具有各自不同的表达模式.外源ABA处理也能显著诱导这3个基因的表达,施用ABA合成抑制剂FLU明显抑制了水分胁迫下CaM基因表达,暗示水分胁迫下CaM基因表达增强依赖于ABA的积累.外源H2O2处理下3个CaM基因均出现2次表达增强的情况,ROS抑制剂或清除剂并不影响外源ABA诱导的CaM基因的前期表达,仅抑制了后期表达,暗示H2O2参与ABA诱导的CaM基因表达后期的调控,它们之间可能存在交谈机制,并且这种机制在不同CaM基因之间具有普遍性.     

欧美杨PdPP2C基因的克隆与功能分析

欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。PdPP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受NaCl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转PdPP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明PdPP2C基因作为一种蛋白磷酸酶提高了拟南芥的抗逆性。      

水稻OsCER4基因启动子序列及表达分析

通过生物信息学方法对水稻(Oryza sativa L.)蜡质合成相关基因OsCER4启动子序列和表达特性进行了分析;通过构建OsCER4启动子驱动的GUS融合表达载体,分析了OsCER4基因的时空表达;并分别以200 mmol/L Na Cl、100μmol/L ABA和1.0%H2O2处理水稻幼苗,通过半定量RT-PCR分析逆境胁迫下OsCER4的表达模式。启动子序列分析表明,OsCER4启动子中包括大量根、茎、叶肉等特异表达位点以及与干旱、冷、盐等多种逆境胁迫相关的调控序列。表达特征分析表明,OsCER4基因在愈伤组织、根、茎、叶中均有表达,在颖壳和子房中也有表达。Na Cl和PEG等逆境胁迫下,OsCER4基因表达量在不同处理时间有所增加,H2O2胁迫下,OsCER4基因表达量有所下降。     

白菜型油菜‘陇油6号’ COR15-like基因的克隆与表达

为探究COR基因在油菜抵御逆境胁迫中的作用,采用RACE技术从白菜型油菜‘陇油6号’克隆获得1个新的COR15-like基因BrCOR15,该基因全长616bp,其中,5′非翻译区59bp,3′非翻译区167bp,开放阅读框390bp,编码129个氨基酸,推测其蛋白分子质量为13.9ku,理论等电点为5.2。该基因编码蛋白质的氨基酸序列与多种植物具有较高一致性,与拟南芥AtCOR15、AtCOR15a,高山离子芥CbCOR15,高山葶苈DaCOR15a、DaCOR15b的氨基酸序列一致性分别为74.6%、77.7%、72.3%、77.9%和76.7%。实时荧光定量PCR分析表明,BrCOR15基因在油菜的茎、叶和下胚轴均有表达,无组织特异性;该基因表达受低温、ABA和H2O2诱导,与单独处理结果相比,经MAPKK抑制剂U0126预处理12h再经低温、ABA和H2O2处理后,BrCOR15基因的表达量明显降低,表明该基因在油菜适应低温、ABA和H2O2胁迫过程中发挥作用。     

拟南芥SOAR1基因响应ABA与渗透胁迫的表达分析

拟南芥PPR蛋白SOAR1是ABA信号转导的关键调节因子。为阐明SOAR1基因表达对ABA和渗透胁迫的响应,以及其对不同时期幼苗生长响应ABA的调控,通过拟南芥基因调控信息网站(AGRIS)分析了SOAR1基因上游可能的转录因子结合位点(顺式作用元件),并进行了不同时期幼苗受ABA诱导的生长抑制试验以及ABA处理、渗透胁迫条件下SOAR1基因的表达分析。结果表明,SOAR1启动子序列中存在多个潜在的应答ABA和逆境胁迫信号的顺式作用元件。SOAR1调控不同时期幼苗生长对ABA的敏感性,SOAR1表达调低的突变体soar1-2显著促进植物对ABA的敏感反应,而SOAR1过表达株系OE1则对ABA显著不敏感。基因表达分析结果显示,SOAR1表达量在低浓度ABA处理6 h后小幅度上调,高浓度ABA处理6 h后变化程度较低;而在低浓度ABA处理后萌发24 h的种子和生长7 d的幼苗中,SOAR1表达随ABA浓度增长而上调。在甘露醇和PEG-6000诱导的渗透胁迫处理后,SOAR1表达受到一定抑制。     

藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选

【目的】通过对抗逆植物藜的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径中MAPKK的胁迫表达模式分析及信号转导途径互作组分的筛选,探索植物藜响应外界胁迫信号诱发逆境耐受的机制。【方法】以藜叶片总RNA为模板,利用定量PCR方法对NaCl、H2O2和ABA胁迫下藜MAPKK表达规律进行了分析。利用RT-PCR结合RACE技术获得了藜MAPKK的全长cDNA序列。利用酵母双杂交技术对MAPKK盐胁迫信号通路互作组分进行了分析。【结果】获得一个藜MAPKK的全长cDNA序列,命名为CaMAPKK2,其开放阅读框为1 089 bp,编码一个由362个氨基酸组成的丝裂原活化蛋白激酶。定量PCR显示CaMAPKK2受盐胁迫诱导明显上调表达,同时受外源H2O2和ABA调控。H2O2合成抑制剂DPI与ABA合成抑制剂Na2WO4显著抑制了300 mmol•L-1 NaCl处理下CaMAPKK2的表达。以全长CaMAPKK2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选到5个可能与CaMAPKK2相互作用的蛋白。测序结果显示,其中1个序列可通读,该cDNA序列长794 bp,与欧洲赤杨（Alnus glutinosa）和拟南芥的噻唑合成酶（thiazole biosynthetic enzyme）基因AgTHI1和AtTHI1核酸序列相似度达79%和78%,其它4个序列没有连续的读码框。【结论】CaMAPKK2受NaCl和H2O2诱导上调表达,暗示盐胁迫可能通过诱导H2O2和ABA的积累从而导致CaMAPKK2表达增加。要进一步筛选CaMAPKK2互作组分需获得更多阳性克隆并开展相关功能验证试验。     

H2O2和ABA对干旱高温复合胁迫诱导的玉米叶片抗氧化防护基因表达的影响

为确定H2O2和脱落酸(ABA)对干旱高温复合胁迫诱导的苗期玉米(Zea mays L.)叶片抗氧化防护系统的影响,利用玉米ABA缺失突变体vp5及其野生型Vp5为试验材料,在不同胁迫下使用H2O2清除剂KI,ABA抑制剂钨酸钠(T)预处理后,测定了体内4个抗氧化防护基因SOD4,GR1,CAT1和cAPX的表达.结果...     

平邑甜茶金属硫蛋白基因MhMT2的克隆和表达分析

【目的】克隆平邑甜茶金属硫蛋白（metallothionein,MT）基因,探讨该基因对逆境的响应机理,为苹果抗逆分子育种提供依据。【方法】采用电子克隆和RT-PCR技术从平邑甜茶叶片中克隆MhMT2基因,利用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推测氨基酸序列进行分析,通过定量PCR技术研究在胁迫条件和激素处理下该基因在叶片中的表达模式。【结果】平邑甜茶MhMT2基因cDNA全长534 bp,具有1个243 bp的完整开放阅读框,编码含80个氨基酸的多肽,其分子量为7.87 kD。同源性比对显示,MhMT2编码的氨基酸序列与其它植物的MT2蛋白有很高的相似性,其中与小金海棠的同源性最高,达到96.4%。MhMT2编码的多肽包含14个Cys残基,其N端富含Cys的结构域具有C-C、C-X-C和C-X-X-C基序,而C端仅有C-X-C基序。聚类分析显示,该基因属于植物MT2基因家族。定量PCR分析表明,MhMT2基因在叶中表达量最高,其次是根,在茎中表达量最低。在ABA、H2O2、机械损伤及NaCl处理下,该基因在叶片中的表达都上调,其中以H2O2最明显。【结论】对MhMT2基因在ABA、H2O2、机械损伤及盐胁迫下的表达模式分析,预示该基因表达水平在植物抗逆反应中起着重要作用。     

胡杨PeSOS1对拟南芥盐诱导H2O2信号途径的调控

【目的】研究胡杨质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)通过H2O2信号途径对盐胁迫的感知和适应作用。【方法】克隆胡杨质膜SOS1基因(PeSOS1),并将其转化到拟南芥中,比较野生型和转PeSOS1基因拟南芥在100mmol/L NaCl胁迫下的萌发率,根长,干质量,K+、Na+和Ca2+含量,活体植株根尖离子流(K+、Na+和H+)的流动情况,H2O2的产生和抗氧化酶活性的变化以及抑制剂对根尖离子流的影响,分析100mmol/L NaCl胁迫下异源表达PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥耐盐性的差异。【结果】在NaCl胁迫下,转PeSOS1基因拟南芥株系的萌发率、根长和干质量明显高于野生型拟南芥;转PeSOS1基因拟南芥K+和Ca2+含量也高于野生型拟南芥,而Na+含量较野生型拟南芥低。100mmol/L NaCl处理后,转PeSOS1基因拟南芥中K+和Na+的平衡(K+/Na+值)与NaCl胁迫前相比下降幅度较小。转PeSOS1基因植株在NaCl胁迫下能更快地产生H2O2,并使抗氧化酶保持较高的活性。SOS1抑制剂阿米洛利(Amiloride)对NaCl胁迫下野生型和转基因拟南芥根尖离子流的变化有明显影响,用质膜NADPH氧化酶抑制剂DPI(抑制H2O2的产生)处理后,转PeSOS1基因拟南芥根尖K+内流减弱,Na+外流和H+内流增强,植株维持K+和Na+平衡的能力减弱。【结论】在拟南芥中异源表达PeSOS1基因可促进H2O2快速产生,维持了SOS1mRNA的稳定性,调控了K+和Na+平衡,并激活了抗氧化防御系统,因而显著提高了其耐盐性。     

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaAQP1 属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫。构建植物表达载体pCAMBIA1304-MaAQP1获得转基因拟南芥植株,GUS 染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部。通过Southern blot 检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验。与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力。     

转耐辐射球菌irrE基因提高拟南芥盐胁迫耐受性的表型分析

耐辐射球菌中的irrE基因作为一种全局性调节因子,在抵御极端辐射照射时起着至关重要的作用。利用农杆菌介导的花序浸染法,将irrE基因转化拟南芥,筛选和鉴定出表达irrE的植株,并分析了转基因植株的盐胁迫耐受能力。结果显示,转irrE拟南芥表现出对盐胁迫的耐受性提高;在盐胁迫下,转基因拟南芥体内脯氨酸含量比野生型有明显的提高。RNA半定量分析显示转基因植株中AtNHX1表达水平升高。因此推测irrE基因在转基因拟南芥中调控了AtNHX1的表达,引起了植株的盐胁迫耐受性提高。     

拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位分析

为明确拟南芥磷酸肌醇特异性磷脂酶C(AtPLC2)的亚细胞定位情况,本研究构建了AtPLC2基因融合GFP标签的表达载体35S:PLC2-GFP,并通过农杆菌介导的遗传转化方法,将重组质粒转化本氏烟草叶片,转基因烟草叶片细胞利用激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光信号与细胞质膜重合,表明拟南芥AtPLC2基因定位于细胞质膜上,研究结果为明确拟南芥AtPLC2基因的功能奠定了良好的基础。     

油菜抗逆基因CBF1植物表达载体的构建及对拟南芥的转化

通过RT-PCR技术从油菜中克隆到抗逆相关基因CBF1,将其成功构建到植物表达载体pCAMBIA1304,并通过农杆菌采用Floral dip法将重组表达载体转入拟南芥。经潮霉素抗性筛选和PCR检测,初步证明,油菜CBF1基因已经转入到拟南芥中。     

白桦BpSPL8启动子的克隆及异源过表达BpSPL8对拟南芥耐旱性的影响

目的目前对植物SPL8的基因功能研究主要集中在开花和育性方面,而其在干旱胁迫响应中的作用却鲜有报道。本文克隆、分析了白桦BpSPL8启动子,并研究了BpSPL8基因在拟南芥中响应干旱胁迫的功能。方法通过PCR克隆技术得到了白桦BpSPL8启动子;利用PLACE和PlantCARE软件对BpSPL8启动子顺式作用元件进行了预测。构建了BpSPL8启动子驱动GUS（β-葡萄糖苷酸酶编码基因）的植物表达载体,并采用浸花法将其转化至拟南芥中;继而利用GUS染色分析了BpSPL8启动子的组织表达模式;同时对BpSPL8在PEG处理下的表达水平进行了qRT-PCR分析。最后,以过表达BpSPL8拟南芥为材料来探究BpSPL8在干旱胁迫下的生物学功能。结果启动子元件分析显示,BpSPL8启动子中含有组织特异表达、光响应、激素响应及多个胁迫响应元件。GUS染色结果表明,BpSPL8启动子可在拟南芥的下胚轴、叶片、叶柄、根和花序中启动GUS基因表达。BpSPL8基因在PEG处理下的野生型白桦的根和叶片中均呈现先上调后下调的表达趋势。干旱胁迫下,过表达BpSPL8拟南芥的存活率和脯氨酸含量均显著低于野生型,丙二醛含量显著高于野生型;两个已知的抗逆基因DR29B和P5CS1在干旱处理后的野生型和转基因拟南芥中均上调表达;但在转基因拟南芥中呈现出延迟上调的表达模式。结论异源过表达白桦BpSPL8能够降低拟南芥的耐旱性,并在干旱胁迫下影响抗性基因DR29B和P5CS1的表达模式。      

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaA QP1属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫.构建植物表达载体pCAMBIA 1304-MaA QP1获得转基因拟南芥植株,GUS染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部.通过Southern blot检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验.与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力.     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因At2G34450的表达及功能鉴定

[目的]研究高等真核生物细胞核中的高迁移率族蛋白B（HMGB）在植物胁迫反应的转录调控中的作用方式。[方法]克隆了拟南芥中编码HMGB蛋白的基因At2G33450,将其转化拟南芥并筛选出超表达的转基因植株,检测干旱、高盐等非生物胁迫对转基因拟南芥的影响。[结果]在盐或干旱胁迫下,过度表达At2G33450的转基因拟南芥与野生型相比,出现萌发及生长迟缓现象。[结论]HMGB蛋白家族中的At2G33450蛋白对各种胁迫条件下拟南芥的生长发育具有重要作用。     

棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶.采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase基转移酶β-CT亚基编码基因αccD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列.将CAC3基因转运肽序列与αccD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-αccD.重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101.渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选.用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,荻转基因烟草植株.T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录.     

单基因及联合双基因转化拟南芥的抗寒性比较

将CBF3、AtGolS3基因通过中间载体连接到植物表达载体pVKH上,形成带有启动子和终止子的双价表达载体,转入拟南芥,以野生拟南芥为对照,与单独导入AtGloS3基因的转基因拟南芥对比,比较两种拟南芥植株抗寒性的差别。结果表明：单基因转拟南芥和联合双基因转化拟南芥的抗寒能力均比野生拟南芥强;而联合双基因转化拟南芥的抗寒能力又比单基因转拟南芥强。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。