胞外ATP、H2O2、Ca2+与NO调控木榄根系离子平衡机理研究

运用非损伤微测技术(NMT),研究了短期盐胁迫下胞外ATP(eATP)、H2 O2 、Ca2 + 与NO 对非泌盐红树木榄根 系K+/Na+ 平衡的调控作用。NaCl(100 mmol/L,24 h)与等渗甘露醇处理的实验表明,木榄根尖对盐胁迫的响应具 有高度的离子特异性。盐胁迫增强了木榄根尖的Na+ 外流,但Na+ 外流被Na+ /H+ 逆向转运蛋白抑制剂Amiloride 和质膜H+ -ATPase 抑制剂Vanadate 抑制,表明Na+ 外流源于根尖表皮细胞质膜Na+ /H+ 逆向转运系统驱动的Na+ 外排。短期盐胁迫处理能诱导木榄根尖K+ 外流,但被氯化四乙胺(TEA,外向K+ 通道抑制剂)明显抑制,证明K+ 外流是由激活的去极化外向型离子通道KORCs 介导。胞外ATP(300 mol/L)、H2 O2 (10 mmol/L)、Ca2 + (10 mmol/ L)与SNP(NO 供体,100 mol/L)均能增加短期盐胁迫下的Na+ 外流,同时抑制K+ 外流。其中,促进Na+ 外流效果 较强的是H2 O2 和Ca2 + ,而Ca2 + 和NO 抑制K+ 外流的效果突出。这些实验结果表明,胞外ATP、H2 O2 、Ca2 + 与NO 这4 种盐胁迫信使是通过上调木榄根系细胞质膜Na+ /H+ 逆向转运体系(Na+ /H+ 逆向转运体和H+ 泵)活性,在促 进Na+ 和H+ 逆向跨膜转运的同时,抑制去极化激活的K+ 离子通道来减少盐诱导的K+ 外流。      

胡杨果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的定位及功能研究

将从胡杨中克隆的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因（PeALD）构建到pGEX-4T—1载体上,经IPTG诱导成功获得融合蛋白GST：PeALD,并将蛋白进行纯化,其大小约为52kD,转化大肠杆菌的耐盐性实验表明,PeALD基因的成功表达有利于提高大肠杆菌菌株的耐盐性。为研究该基因编码蛋白在植物细胞中的定位,将基因的ORF区构建到定位表达载体pMDC85上,通过PEG介导的拟南芥瞬时转化法观察融合蛋白PeALD：GFP在细胞中的定位情况,结果显示该蛋白定位于胞质中,由此说明实验克隆得到的该胡杨果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因编码的是胞质蛋白。烟草种子在盐培养基上的萌发实验结果显示转基因烟草具有更高的耐盐性;烟草水培苗经200mmol／LNaCl处理一周后,可溶性糖的质谱检测结果显示转基因植株中葡萄糖的含量有很大提高。表明胡杨果糖-1,6-二磷酸醛缩酶通过促进糖酵解和有氧呼吸途径来提高植物对盐胁迫的适应性。     

胡杨PeAPY1和PePY2在提高植物抗旱耐盐性上的功能解析

胡杨（Populus euphratica Oliv.）是典型的抗旱耐盐树种,广泛用于干旱盐碱地带的造林绿化。本实验室前期研究结果表明,盐胁迫下胡杨腺苷三磷酸双磷酸水解酶（Apyrase）基因（PeAPY）的转录水平上调,表明该基因可能在胡杨的抗盐性功能上发挥作用。已有研究证明APY是水解eATP的关键酶,而eATP是植物细胞重要的信使分子,调控植物的生长发育及抗性反应。本研究以PeAPY过表达拟南芥株系、拟南芥apy1、apy2突变体和野生型拟南芥为实验材料,分析了胡杨PeAPY对植物抗旱和耐盐能力的影响。研究结果表明,PeAPY1和PeAPY2转基因株系的抗旱性明显提高,这可能与PeAPY1和PeAPY2过表达减少了叶片表皮的气孔密度,降低了叶片的失水速率,从而提高了植株的保水能力有关。此外,我们还发现PeAPY1和PeAPY2转基因株系耐盐能力有所提高：在盐胁迫条件下,过表达PeAPY1和PeAPY2转基因植物的种子萌发率和生长、成活率均明显高于突变体apy1、apy2和野生型拟南芥（NaCl处理的浓度分别为0,50 mmol/L,100 mmol/L,150 mmol/L,200 mmol/L）。这可能是由于盐处理条件下,PeAPY通过降低盐诱导的eATP浓度,阻止了eATP诱导的细胞凋亡。综上所述,胡杨PeAPY的过表达能够提高植物对盐胁迫、干旱胁迫的耐受性,PeAPY对eATP浓度调控及其对植物抗逆性的具体机制有待进一步研究。     

镉胁迫下NO对胡杨细胞Cd2+吸收调控机制的研究

本文研究了NO对胡杨愈伤细胞Cd2+耐受性的影响。结果表明:Cd2+(50 μmol/L)显著抑制了胡杨细胞的生长,而硝普钠SNP(NO供体,25 μmol/L)能明显缓解Cd2+对胡杨细胞生长的抑制作用,并减轻镉对细胞膜的伤害以及镉胁迫导致的细胞活力下降。利用非损伤微测技术等研究了NO对Cd2+动态吸收的影响。CdCl2(50 μmol/L)处理之后,胡杨细胞表现出Cd2+内流,而SNP(25 μmol/L,6 h)显著抑制了Cd2+的内流,并降低了Cd2+在细胞内的积累。研究发现,NO是通过调控钙离子通道来抑制胡杨细胞对Cd2+的吸收。镉胁迫下Cd2+内流被钙离子通道专一性抑制剂氯化镧明显抑制,表明Cd2+是通过钙离子通道转运进入细胞。并且发现,NO是通过促进Ca2+的内流来竞争性地抑制胡杨细胞对Cd2+的吸收,从而缓解了镉胁迫对胡杨细胞造成的生长抑制。      

胡杨PeSOS1对拟南芥盐诱导H2O2信号途径的调控

【目的】研究胡杨质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)通过H2O2信号途径对盐胁迫的感知和适应作用。【方法】克隆胡杨质膜SOS1基因(PeSOS1),并将其转化到拟南芥中,比较野生型和转PeSOS1基因拟南芥在100mmol/L NaCl胁迫下的萌发率,根长,干质量,K+、Na+和Ca2+含量,活体植株根尖离子流(K+、Na+和H+)的流动情况,H2O2的产生和抗氧化酶活性的变化以及抑制剂对根尖离子流的影响,分析100mmol/L NaCl胁迫下异源表达PeSOS1基因拟南芥与野生型拟南芥耐盐性的差异。【结果】在NaCl胁迫下,转PeSOS1基因拟南芥株系的萌发率、根长和干质量明显高于野生型拟南芥;转PeSOS1基因拟南芥K+和Ca2+含量也高于野生型拟南芥,而Na+含量较野生型拟南芥低。100mmol/L NaCl处理后,转PeSOS1基因拟南芥中K+和Na+的平衡(K+/Na+值)与NaCl胁迫前相比下降幅度较小。转PeSOS1基因植株在NaCl胁迫下能更快地产生H2O2,并使抗氧化酶保持较高的活性。SOS1抑制剂阿米洛利(Amiloride)对NaCl胁迫下野生型和转基因拟南芥根尖离子流的变化有明显影响,用质膜NADPH氧化酶抑制剂DPI(抑制H2O2的产生)处理后,转PeSOS1基因拟南芥根尖K+内流减弱,Na+外流和H+内流增强,植株维持K+和Na+平衡的能力减弱。【结论】在拟南芥中异源表达PeSOS1基因可促进H2O2快速产生,维持了SOS1mRNA的稳定性,调控了K+和Na+平衡,并激活了抗氧化防御系统,因而显著提高了其耐盐性。