乙酰辅酶A羧化酶的结构·功能及基因的研究进展

乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase,ACCase）属于生物素包含酶类型Ⅰ,在生物体内催化乙酰辅酶A形成丙二酰辅酶A。在植物中乙酰辅酶A羧化酶主要有异质型和同质型2种;在动物中乙酰辅酶A羧化酶属同质型,分为ACC1和ACC2 2种类型。主要介绍了分布于双子叶植物以及非禾本科单子叶植物的质体中的异质型ACCase的亚基组成、结构、功能及其编码基因。ACCase由生物素羧化酶（Biotincarboxylase,BC）亚基、生物素羧基载体蛋白亚基（Biotincarboxyl Camer Protein,BCCP）、羧基转移酶的α-CT亚基和β-CT亚基4种亚基构成,有3个功能结构域,即BC功能结构域、BCCP功能结构域以及CT功能结构域。除β-CT亚基由质体基因编码外,其他亚基由核基因编码,在细胞质中合成后转运到质体中组成功能蛋白,参与脂肪酸的合成。     

烟草和拟南芥表皮毛中特异表达iaaM后的遗传效应

利用色氨酸单加氧酶基因iaaM与拟南芥表皮毛特异表达GL2基因启动子重组后,构建了在植物表皮毛细胞中特异表达iaaM基因的重组基因载体;采用根癌农杆菌叶盘转化法将重组基因转化到烟草WS38(对照)中,筛选和鉴定出了6株转化烟草植株;将该重组基因以根癌农杆菌花序浸渍法转至拟南芥(Colombia ecotype,对照),筛选出9株拟南芥转化植株,并对稳定转化的转基因植株表皮毛进行观察。结果表明:转基因烟草表皮毛较对照植株显著增长,其长度最长为对照的2.2倍,但转基因拟南芥表皮毛长度与对照间无显著差异。对烟草幼叶进行生长素浓度检测,转iaaM基因烟草吲哚乙酸含量显著提高,说明iaaM在烟草表皮毛细胞中表达,使其合成和积累更多的生长素;转基因拟南芥和烟草表皮毛密度均较对照显著增加,证明植物表皮毛发育模式中GL2表达的特异性受细胞内生长素的影响。     

烟草转录因子基因NtGRAS-R1的克隆与功能分析

为了分析NtGRAS-R1的生物学功能,在NCBI上BLAST植物的EST数据库拼接获得Nt-GRAS-R1的全长序列;根据该序列设计特异引物,利用PCR方法从烟草根系cDNA 中扩增Nt-GRAS-R1,将其连接到pS1300表达载体上,采用农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥,采用RT-PCR法检测转基因拟南芥植株;获得稳定转基因拟南芥后观察生长性状,并用qPCR方法检测At-CLV3基因的表达情况。结果显示,NtGRAS-R1基因属于HAM亚家族,编码508个氨基酸;观察发现,转基因拟南芥植株根长和根体积明显大于野生型;qPCR结果表明,转基因拟南芥AtCLV3的表达量明显低于野生型拟南芥。初步表明NtGRAS-R1参与根系生长发育调控过程。     

苹果MdAFS基因亚细胞定位表达载体的构建及分析

为研究萜烯合酶亚细胞定位的改变对植物萜类及其生长发育特性的影响,以青香蕉苹果(Malus domestica Borkh cv.White Winter Pearmain)果皮、菊花、酵母和拟南芥为材料,采用PCR技术分别克隆了α-法尼烯合酶基因(AFS)、Rubisco强启动子(Ru)、线粒体定位转运肽(Mit)与叶绿体定位转运肽(Pla),并利用plant CARE软件和Signal P4.1Server网站对所得启动子和转运肽序列进行了预测分析。结果表明Ru序列具备强启动子特有的TATAbox、CAATbox以及多种相关的激素响应元件,且所得线粒体和叶绿体定位转运肽也均预测到转运肽的功能。利用所得的以上序列分别构建了由Ru强启动子驱动的线粒体和叶绿体定位的AFS基因表达载体,并成功转化获得了转基因烟草植株,实时荧光定量PCR表明目的基因在转基因植物中有较高的表达,并且存在空间表达特异性。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

大豆α′基因在烟草植株中的表达

将大豆种子7s 贮藏蛋白α'亚基基因通过含改装 Ti 质粒的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染转化烟草叶片,并使转化组织再生成完整植株。所有再生的转基因烟草植株正常开花结籽,形在态上未发生任何变化。Southern 杂交证明,α'亚基基因已插入烟草基因组中。ELISA 分析表明,转基因植株种子中α'亚基蛋白的含量显著高于非转化植株,而在叶和茎中α'亚基蛋白的含量转化植株和非转化植株并无差异。说明α'亚基基因在转化植株中可以表达,但只在种子中积累,而不在叶片和茎中积累。由此可见,α'亚基基因在转基因烟草中的表达和积累方式与在大豆中的表达和积累方式是一致的。另外,对三株转基因植株的后代幼苗进行胭脂碱检测,表明α'亚基基因在转基因烟草中稳定遗传,后代分离比例为3:1,符合孟德尔遗传规律,故α亚基基因是以单位点的形式整合到受体的染色体上,符合一对因子遗传的规律。     

表达全长与截短HarpinXoo对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105.采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株.通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析.结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达.用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白.抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hffA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性.     

表达全长与截短HarpinXoo对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105.采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株.通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析.结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达.用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白.抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hffA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性.     

马铃薯Y病毒复制酶基因的转基因烟草对PVY的抗性

将农杆菌LBA4404/pAL4404、pBin438双元载体上的NIb基因正义序列、反义序列、5''-缺失序列及新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)转入烟草品种NC89的染色体,获得抗卡那霉素的转化再生烟草植株.经抗性筛选、PCR检测、无性扩繁和大量重复抗病鉴定,结果表明,转化烟草植株DNA中整合了外源目的基因;NIb基因正义序列、5''-缺失序列转化再生植株中,均出现抗10μg/mlPVY侵染的植株;NIb基因反义序列转化再生植株仅部分抗5μg/mlPVY侵染.ELISA分析认为抗性植株无病毒累积.初步筛选出对PVY侵染具有较高抗性的转基因烟草植株.     

水稻WRKY16基因分析及其转化拟南芥研究

通过酵母单杂交方法从水稻中获得编码转录因子的WRKY16基因.序列分析表明,WRKY16蛋白属于WRKY转录因子家族第二类别.利用根癌农杆菌进行WRKY16基因的拟南芥转化,GUS组织化学染色和PCR检测证明WRKY16基因已经转入拟南芥中,RT-PCR检测进一步证明该基因已在转基因植株得到表达.     

马铃薯3GT基因转化拟南芥引起花色苷大量积累

为了验证马铃薯野生种3GT（UDP?鄄glucose：flavonoid 3?鄄0?鄄glucosyltransferase,类黄酮3?鄄O?鄄葡萄糖基转移酶）基因的功能,构建了携带CaMV 35S启动子的表达载体pG3GT并转化农杆菌GV3101。用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T0代种子进行筛选,先后得到4个阳性幼苗,转化率为0.13%。对移栽成活的3株抗性植株进行PCR检测为阳性,Southern blot分析有2株表现为阳性并为单拷贝整合,其中一株的叶片和茎杆颜色变成紫红色;经花色苷含量的测定表明其含量比野生型植株高出7.01倍。     

农杆菌介导法将pac1基因转入烟草的研究

以烟草叶片为外植体,利用农杆菌介导法首次将pac1基因转入吉林省主栽烟草品种吉烟9号、龙江911-21和云烟87中.经过卡那霉素抗性筛选,初步获得吉烟9号转化植株43株、龙江911-21转化植株61株、云烟87转化植株43株.经PCR检测,转化烟草吉烟9号的PCR阳性率为21/43,龙江911-21的PCR阳性率为32/61,云烟87的PCR阳性率为24/43.经PCR检测为阳性的植株均能扩增出与目的片断大小一致的特异性条带,初步表明pac1基因已经转到这些烟草基因组中.从PCR扩增稳定的转基因烟草中随机抽取5株,同时以非转基因烟草为对照,进行Southern Blot分析,结果表明目的基因pac1己经被成功地整合到烟草基因组中.     

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaA QP1属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫.构建植物表达载体pCAMBIA 1304-MaA QP1获得转基因拟南芥植株,GUS染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部.通过Southern blot检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验.与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力.     

MaAQP1过表达拟南芥及对转基因植株抗旱性的分析

MaAQP1 属于水通道蛋白家族的基因,其能响应干旱胁迫。构建植物表达载体pCAMBIA1304-MaAQP1获得转基因拟南芥植株,GUS 染色分析表明,其主要分布于转基因植株的根部。通过Southern blot 检测,选取双拷贝和单拷贝的两个转基因植株进行后续试验。与野生型植株相比,经过干旱胁迫处理后,转基因植株具有较高的存活率,脯氨酸、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶含量增加,同时其丙二醛含量降低,提高了对干旱胁迫的抵御能力。     

过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性

Na+/H+逆向转运蛋白调节细胞内的离子平衡,在植物耐盐性起重要的作用。为了研究甜菜液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白BvNHX1基因在植物耐盐中的作用,构建了植物表达载体pROKⅡ-BvNHX1转化拟南芥.在含有卡纳霉素的培养基上筛选转化子,并利用Southern和Northern杂交技术检测,进一步证实BvNHX1基因已整合到拟南芥基因组并能正常转录。选取纯合转基因株系进行耐盐性分析实验表明,过量表达BvN-HX1基因的拟南芥在种子萌发和苗期都提高了植株耐盐性,盐处理下转基因植株的鲜重、干重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。结果表明过量表达BvNHX1基因提高了转基因拟南芥的耐盐能力。     

油菜β-CT亚基编码基因accD的SNPs分析及其分子进化

以含油量不同的32份甘蓝型油菜自交纯合系为材料,用直接测序法筛查β-CT亚基的accD编码基因DNA序列的单核苷酸多态性,包括98%的编码区序列共1380 bp。在32份材料中只在材料18和20两个材料中发现了一个相同的SNP,SNP频率为1/1380,单倍型多态性指数Hd=0.121;核苷酸多态性π=0.00009,θ=0.00018。Tajima’s D值为不显著负值,Fu&Li’s检测,各个参数均为不显著正值,Z检验结果中(dN-dS)值也为不显著正值,说明accD基因没有偏离中性进化。系统发育树表明,accD基因在所选的32个油菜材料中是高度保守的,与拟南芥的序列相似度高达95.7%,说明accD基因在物种间也是高度保守的。暗示其在种子油脂合成过程中起着不可替代的作用,此外说明,仅用β-CT亚基编码基因的单核苷酸多态性还不能解释含油量复杂的表现型,还需在更大的群体资源中扩增accD编码基因和其它亚基编码基因进行单核苷酸多态性与含油量表型的相关性研究。     

AtICE1和AtCBF1~3基因表达载体的构建与转化烟草研究

植物抗寒属于复杂的数量性状。单一基因转化,植株抗寒性提高有限。本文利用拟南芥的AtCBF1~3和AtICE14个基因构建植物表达载体pVCT2276,通过农杆菌介导法转化烟草,获得35株抗性苗。经抗性筛选以及PCR鉴定,8株显示为阳性植株。将其中5株繁殖成株系,为后续的抗寒鉴定奠定基础。     

Transformation of Arabidopsis thaliana with Agrobacterium tumefaciens

Transformed Arabidopsis thaliana plants have been produced by a modified leaf disk transformation-regeneration method. Leaf pieces from sterilely grown plants were precultured for 2 days and inoculated with an Agrobacterium tumefaciens strain containing an avirulent Ti (tumor-inducing) plasmid with a chimeric gene encoding hygromycin resistance. After cocultivation for 2 days, the leaf pieces were placed on a medium that selects for hygromycin resistance. Shoots regenerated within 3 months and were excised, rooted, and transferred to soil. Transformation was confirmed by opine production, hygromycin resistance, and DNA blot hybridization of both primary transformants and progeny. This process for producing transgenic Arabidopsis plants should enhance the usefulness of the species for experimental biology.     

冷诱导转录因子基因CBF3转化黄瓜的研究

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子CBF3基因,将其与CaMV35S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35S-CBF3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。经PCR检测鉴定,表明CBF3基因已整合到黄瓜基因组中。     

BcMF3反义基因植物表达载体的构建及其对拟南芥的遗传转化

根据编码白菜(Brassica rapa L. ssp. chinensis,syn B. campestris ssp. chinensis)果胶甲酯酶的BcMF3 基因cDNA 序列内部第1 343～1 797个碱基之间序列设计引物,从白菜花蕾cDNA中PCR扩增出455 bp的片段,把该片段作为反义基因连接至双元载体pBI12l上,得到了植物表达栽体pBI-B3,并用"三亲杂交"法导入农杆菌LBA4404菌株中,PCR扩增和酶切结果表明所构建的植物表达载体pBI-B3含有BcMF3 反义基因片断,并已导入了根癌农杆菌(Agrobacterinm tumefuciens)中;采用花序浸润法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)后,播种筛选浸润植株的种子获得了5 株卡那霉素抗性植株,PCR 扩增证明BcMF3反义片段成功整合到拟南芥基因组中;转基因拟南芥子代(T2)的抗性分离符合孟德尔分离比例,表明外源基因是单一位点插入.