表达全长与截短HarpinXoo对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105.采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株.通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析.结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达.用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白.抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hffA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性.     

水稻白叶枯病菌及其毒素引起烟草叶片组织坏死机制的研究

 水稻白叶枯病菌JXO Ⅲ细胞悬浮液及其分泌的毒素溶液接种到烟草叶片中,都能在烟草叶片上产生快速的坏死反应。引起坏死反应所需的最短时间分别为接种后8 h和0.5 h。低浓度的JXOⅢ(< 107 cfu/ml)接种后36~48 h内形成褪绿斑,而低浓度的毒素(< 2.5 mg/ml)接种后随时间延长在接点无任何可见变化。依文斯蓝(Evans blue)染色发现,毒素和JXOⅢ分别在接种后0.5 h和6 h内细胞大量死亡。叶圆片法测定表明,接种毒素后2 h内烟草细胞膜透性迅速上升,接种JXOⅢ后9 h细胞膜透性开始明显上升。毒素处理的烟草叶片中LOX、POX、SOD、CAT活性水平较对照降低,而JXOⅢ处理中上述酶活性较对照有不同程度的增加。蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺,RNA合成抑制剂放线菌素D和钙离子通道阻断剂氯化镧分别以7.1×10^-5 M、1×10^-4 M和1×10^-3 M浓度有效地抑制JXOⅢ在烟草上形成坏死反应,这些抑制剂对毒素在烟草上的坏死反应则没有影响。     

大白菜软腐病菌游动性突变体在大白菜体内增殖扩展研究

 用培养皿滤纸吸附测定法和不伤根土壤拌菌处理及针刺接种法,测定了大白菜软腐病菌游动性突变体进入大白菜体内、并在其中侵染定殖和扩展的特性。结果表明,游动性丧失和增强的突变体都可以通过种子萌发和主动接触进入大白菜体内、并可以在体内有短期的繁殖,但菌量远低于野生菌。大白菜叶片接种实验说明,这两种突变体也都可以进行短距离扩展,但扩展距离和菌的繁殖量低于野生菌。     

桉树对青枯病抗性与过氧化物酶及同工酶关系的研究

对７个具有不同青枯病抗性的桉树品系的叶部和根部的过氧化物酶活性进行了测定,对同工酶进行了电泳分析。酶活性测定结果表明,桉树各品系叶部的过氧化物酶活性显著高于根部。对青枯病具有不同抗性的７个桉树品系,其叶部的过氧化物酶活性存在着显著差异。对青枯病抗性较弱的Ｆ１１和Ｅ１３品系体内的过氧化物酶显著比其它抗性品系体内的酶活性低。同工酶电泳分析表明,桉树对青枯病不同抗病性品系之间的同工酶谱带,在条带数和各条     

水稻白叶枯病菌酸性还原酮加双氧酶的鉴定分析

 酸性还原酮加双氧酶(ARD)催化很多原核和真核生物中的甲硫氨酸急救途径(MSP)倒数第二步。本研究鉴定了水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)中的酸性还原酮加双氧酶, 命名为xard。Xoo 菌株PXO99^A、MAFF311018和KACC10331中的xard核苷酸序列完全相同。xard基因突变菌株在甲硫基腺苷(MTA)为唯一硫源时不能正常生长。这一结果证明Xard在MSP中起作用。xard突变体和野生型菌株PXO99^A 接种水稻IR24后病斑长度数据表明该基因突变对Xoo在水稻上的毒性没有影响。     

小麦类蛋白激酶基因片段TA50-10的克隆及其TMV抗性诱导功能

TA50-10是小麦中的一个截短的cDNA序列,与水稻白叶枯病菌harpin蛋白基因hpa1x∞(又称hrfl,hrfA)具有59％的一致性,它编码的多肽有类蛋白激酶催化域(Protein kinase like domain).为了研究TA50-10蛋白质的生物学性状和功能以及与harpin蛋白的关系,用PCR法从小麦cDNA中扩增到TA50-10基因,并以pET30a(+)为载体构建了原核表达重组体pEY30-TA50-10.将其转化大肠杆菌后在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的诱导下获得了表达蛋白质,并研究了该表达蛋白质诱导烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的作用.结果表明:原核表达的TA50-10蛋白质具有热稳定性;用热处理后部分纯化的TA50-10蛋白质溶液喷施烟草叶片能够诱导三生烟草局部抗TMV,并且诱抗效果在处理后10 d内没有明显改变.     

水稻白叶枯病菌avrBs3/PthA家族基因的随机缺失及突变体PXO99Δavr功能的研究

利用来源于水稻白叶枯菌株JXOⅢ的无毒基因avrXa3构建的同源序列突变转化单元,同源重组得到PXO99~A菌株的1个缺失突变体PXO99△avr。PXO99~A及其突变体基因组DNA以内切酶BamHⅠ完全消化后进行同源检测,发现突变体PXO99△avr中有3条杂交带消失,有2条带信号减弱。进一步以相同探针检测PXO99~A的基因文库,限制性酶切分析和Southern杂交归类,共获得13个不同的阳性克隆。众多avrBs3/PthA基因在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列。经比对,克隆p5所含条带与突变体缺失的5条带大小相同。因此认为随机交换产生的突变体中有5个基因被敲除。将此文库克隆(p5)分别导入PXO99~A和突变体PXO99△avr中,苗期接种试验表明:p5互补突变体能使其毒性恢复接近PXO99~A的致病表型,推测此克隆正是突变体缺失的基因。同时也表明:缺失的5个串联基因的综合作用主要表现为毒性功能。     

水稻IR26悬浮细胞与白叶枯病菌互作的过敏反应现象

 当水稻IR26悬浮细胞与白叶枯病菌的不亲和小种(JXOV)互作时,在数小时内,悬浮细胞死亡率可达60%、膜透性增加40%、呼吸升高一倍多,而水稻IR26悬浮细胞与白叶枯病菌的亲和小种(JXOⅢ)互作时,在数小时内,悬浮细胞死亡率只有20%、膜透性只增加20%、呼吸升高不足40%,这些数据表明在水稻悬浮细胞与白叶枯病菌互作系统中可能存在着和水稻植株与白叶枯病菌互作系统中相似的互作机制。     

胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜亚种游动性突变体的筛选

 用转座子Tn5对胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)进行诱变,获得9个游动性改变了的突变体。M432游动性变大;M143、M451和M574游动性完全丧失;M43、M49、M330、M725和M726游动性较野生型变小。这9个突变体在大白菜叶柄上的致病力均减弱。游动性变小或丧失的突变体鞭毛数目减少或未发现有鞭毛。     

表达全长与截短HarpinXoo对转基因烟草抗病性的影响

将水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)编码HarpinXoo的hrfA基因及其N-末端缺失突变基因AB分别连接到双元载体pBI121上,构建成转基因载体,并经冻融法转化土壤杆菌EHA105.采用叶盘法转化烟草,用卡那霉素抗性筛选再生植株.通过PCR扩增检测了转化烟草中的靶基因序列及35S启动子序列,对T1代PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交和RT-PCR分析.结果显示,外源基因已经整合到转基因烟草基因组中,并在转录水平正常表达.用从转hrfA基因和AB片段的烟草中提取的可溶性蛋白注射烟草都能引起过敏反应,说明目的基因在转基因烟草中能表达出有活性的蛋白.抗病性鉴定结果表明,转N-末端AB片段的烟草和转hffA全长基因的烟草一样表现出对烟草花叶病毒(TMV)的抗性.