苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。     

平邑甜茶新根扩展蛋白基因MhEXP1的cDNA全序列克隆及表达

【目的】对平邑甜茶[Malus hupehensis（Pamp）Rehd. var pinyiensis Jiang]新根扩展蛋白基因进行克隆和表达分析,为揭示扩展蛋白在平邑甜茶根系生长发育中的功能打下基础。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术克隆扩展蛋白同源基因,并通过Northern杂交研究其在不同器官中的表达情况及吲哚丁酸（IBA）的处理效应。【结果】成功地从平邑甜茶白色新根中获得了一个全长的扩展蛋白基因,命名为MhEXP1,GenBank登录号为DQ538346。MhEXP1 cDNA全长1 111 bp,含有771 bp的完整开放阅读框,编码257个氨基酸,预测分子量和等电点分别为27.8kD和8.9。序列分析表明,MhEXP1具有扩展蛋白的典型结构,即氨基酸序列N端有８个半胱氨酸残基,1个组氨酸（His-Phe-Asp,HFD）域,C末端存在4个保守的色氨酸残基。Northern杂交表明,该基因在平邑甜茶叶片中表达量很低,但在新根中大量表达并受IBA诱导,且随着IBA处理时间的延长表达量逐渐增加。【结论】成功地从平邑甜茶中克隆了一个全长的扩展蛋白基因MhEXP1,该基因在叶片中表达量很低但在新根中大量表达,并受IBA诱导;MhEXP1参与IBA调节的平邑甜茶根系生长发育。     

紫花苜蓿抗逆基因MsDUF的克隆及其功能分析

【目的】克隆紫花苜蓿（Medicago sativa L.）抗逆新基因MsDUF,并对其进行序列特征分析,了解该基因在逆境胁迫下的表达模式。【方法】利用RACE法获得紫花苜蓿MsDUF全长的cDNA序列,对该序列进行生物信息学分析;用基因枪法进行MsDUF的亚细胞定位分析;采用实时荧光定量PCR研究该基因在高含量NaCl和PEG-6000的胁迫下,以及ABA和GA3诱导下的表达模式。【结果】测序结果显示,该基因cDNA全长714 bp,包含一个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸,命名为MsDUF,GenBank登录号为JX183734。氨基酸BLASTP分析表明,MsDUF氨基酸序列与拟南芥、大豆和蒺藜苜蓿等具有53%—98%的相似性,属于DUF4228 superfamily。实时荧光定量PCR研究表明,该基因在逆境胁迫下上调表达。【结论】从紫花苜蓿中克隆了抗逆相关基因MsDUF,发现其定位于细胞质中,实时荧光定量PCR结果分析表明该基因在紫花苜蓿的抗逆反应中起着重要作用。     

藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选

【目的】通过对抗逆植物藜的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径中MAPKK的胁迫表达模式分析及信号转导途径互作组分的筛选,探索植物藜响应外界胁迫信号诱发逆境耐受的机制。【方法】以藜叶片总RNA为模板,利用定量PCR方法对NaCl、H2O2和ABA胁迫下藜MAPKK表达规律进行了分析。利用RT-PCR结合RACE技术获得了藜MAPKK的全长cDNA序列。利用酵母双杂交技术对MAPKK盐胁迫信号通路互作组分进行了分析。【结果】获得一个藜MAPKK的全长cDNA序列,命名为CaMAPKK2,其开放阅读框为1 089 bp,编码一个由362个氨基酸组成的丝裂原活化蛋白激酶。定量PCR显示CaMAPKK2受盐胁迫诱导明显上调表达,同时受外源H2O2和ABA调控。H2O2合成抑制剂DPI与ABA合成抑制剂Na2WO4显著抑制了300 mmol•L-1 NaCl处理下CaMAPKK2的表达。以全长CaMAPKK2为诱饵蛋白,利用酵母双杂交技术筛选到5个可能与CaMAPKK2相互作用的蛋白。测序结果显示,其中1个序列可通读,该cDNA序列长794 bp,与欧洲赤杨（Alnus glutinosa）和拟南芥的噻唑合成酶（thiazole biosynthetic enzyme）基因AgTHI1和AtTHI1核酸序列相似度达79%和78%,其它4个序列没有连续的读码框。【结论】CaMAPKK2受NaCl和H2O2诱导上调表达,暗示盐胁迫可能通过诱导H2O2和ABA的积累从而导致CaMAPKK2表达增加。要进一步筛选CaMAPKK2互作组分需获得更多阳性克隆并开展相关功能验证试验。     

高粱SbNAC1基因克隆及初步分析

【目的】在植物抗逆信号转导途径中,NAC转录因子处于承上启下的关键位置,通过调控靶基因的表达发挥抗逆功能。本研究克隆高粱SbNAC1基因全长cDNA,并对其进行序列比对、进化分析,为深入研究其在作物抗逆反应中的生物学功能奠定基础。【方法】RT-PCR扩增SbNAC1全长cDNA,并对其进行基因序列比对和系统进化分析等生物信息学分析。【结果】SbNAC1cDNA全长966bp,编码321个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明高粱SbNAC1与水稻SNAC1同源性达到83.69%。     

一个新的小麦非生物胁迫诱导基因的克隆及表达特性

 【目的】水分胁迫和低温是制约植物生长发育的重要限制因子，研究植物感知、传递胁迫信号，并对重要的基因进行克隆对改良作物的抗性有重要意义。本试验的目的是克隆与水分胁迫相关的基因，通过基因的功能进一步了解植物的抗旱机制，并为抗逆育种提供候选基因。【方法】试验应用噬菌体原位杂交技术从小麦旱胁迫cDNA文库中克隆了一个水分胁迫诱导基因片段W89。用5′-RACE和RT-PCR方法，获得了W89基因的全长序列。【结果】W89全长cDNA为2 392 bp，其中，编码区长1 896 bp，编码631个氨基酸。Southern杂交表明，W89是一个单拷贝基因。RT-PCR结果表明，W89受干旱、低温和ABA的诱导。氨基酸序列分析发现W89有一个DUF248保守区（pfam03141），包含一个具有SAM （Sterile Alpha Motif）结合基序的甲基转移酶区。同源性分析发现W89与一个水稻干旱诱导蛋白（BAD67956）的同源性为66%，推测W89可能是一个新的小麦干旱诱导的基因。【结论】根据甲基转移酶和SAM结合基序的功能，推测W89的SAM结合基序可能与其它蛋白或转录因子相互作用调控植物胁迫基因的表达，并且可能在干旱胁迫的早期调控信号的转导。     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

木薯MeASR3基因的克隆及表达分析

【目的】克隆木薯脱落酸、胁迫、成熟诱导蛋白(abscisic acid, stress, ripening-induced, ASR)的cDNA序列,检测该基因在ABA、H_2O_2、NaCl和甘露醇4种处理下的表达模式,为揭示ASR基因在木薯耐旱机制中的作用提供参考。【方法】以木薯KU50叶片总RNA反转录的cDNA为模板,利用PCR的方法扩增获得一个ASR家族基因,对其进行了氨基酸序列比对和进化树分析,并利用荧光定量PCR技术对该基因在多种处理下的表达模式进行分析。【结果】克隆得到的cDNA长度为459 bp,编码153个氨基酸,命名为MeASR3 (GeneBank登录号:XM_021744431.1)。序列比对结果表明MeASR3含有ASR家族蛋白的主要特征功能域,进化树显示MeASR3与橡胶树来源的ASR蛋白亲缘关系最近。荧光定量结果表明MeASR3在转录水平受到H_2O_2、甘露醇和高盐胁迫的诱导作用,同时受到ABA的抑制作用。【结论】克隆获得木薯MeASR3基因,该基因在转录水平响应ABA处理以及氧化、高盐和干旱胁迫,可能参与到ABA以及多种胁迫下的信号转导途径,可作为候选基因用于木薯耐旱机制的研究。     

玉米ZmSCL7的克隆及功能研究

【目的】对玉米SCARECROW-LIKE 7（SCL7）进行克隆与表达研究,了解该基因表达的分子机制及其应用。【方法】以玉米叶片总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得ZmSCL7的全长cDNA序列。利用同源性比对进行序列分析,通过Northern杂交分析ZmSCL7在不同逆境胁迫下的表达特征,对转基因烟草进行Western blot分析,并测定最大光化学效率、叶绿素、丙二醛和脯氨酸含量验证该基因的抗盐功能。【结果】获得ZmSCL7全长cDNA序列1 653 bp,编码550个氨基酸。Northern杂交表明该基因在NaCl、H2O2和低温处理条件下上调表达,在ABA处理条件下下调表达。与对照相比,转ZmSCL7烟草在200 mmol•L-1NaCl时萌发受到较小抑制,且最大光化学效率、叶绿素和脯氨酸含量上升,丙二醛含量下降。【结论】ZmSCL7作为一个转录因子受多种逆境胁迫诱导,该基因的过量表达提高了烟草的抗盐性。     

橡胶树PEPC基因的克隆、生物信息学和表达分析

【目的】克隆橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的全长cDNA,通过生物信息学和基因表达分析,为基因功能研究奠定基础。【方法】根据橡胶树PEPC基因片段序列设计引物,通过RACE获得cDNA全长,用DNAMAN软件预测编码多肽序列,用Prot Param工具分析多肽基本理化性质,用NCBI-Blast工具搜索同源的核酸及多肽序列,用Clustal X2.0软件比对不同植物来源的多肽序列,并用MEGA 6.06软件构建系统进化树,用Real-time RT-PCR分析基因表达模式。【结果】从橡胶树胶乳中克隆到一个新的PEPC基因的全长cDNA,其长度为3206 bp,包含一个2898 bp的开放读码框(ORF),112 bp的5’UTR和196 bp的3’UTR。预测该基因编码965个氨基酸的多肽(HbPPC2),其分子量为110.35 kDa,等电点为5.76;该基因的编码区核苷酸序列和其编码多肽氨基酸序列分别与早期克隆的橡胶树HbPPC1基因(KJ721228)的编码区和编码多肽序列有81.3%和92.1%的同源性。预测HbPPC2定位于细胞质,为不稳定蛋白,其活性受多种因素调控。预测HbPPC2酶活性中心是其第172位残基His,磷酸化位点是其第11位残基Ser,单泛素化位点是其第628位残基Lys。其第178、179、226和366位残基Arg在三维结构中靠近,构成葡萄糖-6-磷酸(G6P)的结合位点;其第450、641、753、767位残基Arg在三维结构中靠近,构成PEP的结合位点。HbPPC2基因在叶片、树皮、胶乳、雄花、雌花均有表达,在胶乳表达量最高;乙烯利处理显著下调该基因在胶乳的表达。【结论】本研究可为橡胶树PEPC功能研究提供理论基础。     

湖北海棠病程相关蛋白MhPR8基因的克隆与表达

【目的】从湖北海棠叶片中克隆植物第Ⅲ类几丁质酶基因PR8的cDNA序列和基因组DNA序列,研究化学试剂SA、MeJA、ACC、ABA,非生物胁迫NaCl和低温（4℃）,生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导下MhPR8基因的表达特性。【方法】利用PCR技术分别从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库和基因组DNA中克隆MhPR8基因全长序列;利用生物信息学方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因的表达特性。【结果】该基因编码区为897 bp,编码298个氨基酸,蛋白质分子量为31.67 kD,等电点为4.77,命名为MhPR8。该基因在其编码区内部没有内含子。MhPR8蛋白含有保守的结构域GH18_hevamine_XipI_class_III,属于第III类几丁质酶。该蛋白含有6个保守的半胱氨基酸残基,含有植物第III类几丁质酶起催化作用的天冬氨酸和谷氨酸,分别位于第151和153位氨基酸。qRT-PCR分析结果表明,该基因在湖北海棠根中的表达量最大;SA、MeJA和ACC明显诱导该基因的表达,ABA略微诱导该基因的表达;低温诱导该基因的表达,而NaCl诱导该基因的表达不明显;生物胁迫苹果轮纹病病原菌和苹果蚜虫诱导该基因的表达。【结论】湖北海棠MhPR8可能参与SA、JA/ET介导的信号通路中,在湖北海棠抵抗生物胁迫和非生物胁迫中起着非常重要的作用。     

小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的克隆及其对非生物胁迫的响应

【目的】分析小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的特征及其对非生物胁迫的响应,并探讨其在小麦抗逆调控过程中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆了该基因cDNA全长,采用生物信息学方法分析克隆基因编码蛋白的特性,并通过半定量RT-PCR分析该基因在非生物胁迫条件下的表达特性。【结果】TaPM19-1的cDNA全长1 090 bp,无内含子,编码蛋白包含182个氨基酸,分子量为19.02 kD,包含有典型的AWPM19保守域;依据氨基酸序列将来源于不同植物的16个AWPM19类蛋白分为3组,TaPM19-1与2个来源于大麦及1个二穗短柄草的AWPM19类蛋白亲源关系最近,同属于第三组。高级结构分析显示,TaPM19-1可形成4个由α-螺旋组成的跨膜域,N端位于膜内,包含由27个氨基酸组成的信号肽,C端近40个氨基酸位于膜内。表达分析显示,TaPM19-1除在发育后期的种子中有较高水平表达外,其它组织中未检测到表达;在所检测的2个小麦品种根系中,TaPM19-1的表达受ABA诱导,但在叶片中的表达量极低;水分胁迫条件下,该基因在根系和叶片中均呈现较强的诱导表达特性;在高盐和高温胁迫条件下,该基因在洛旱2号小麦中均可诱导表达,而在中国春小麦中未检测到该基因表达;在低温胁迫条件下,未检测到TaPM19-1的表达。【结论】获得了小麦质膜蛋白基因TaPM19-1的cDNA全长,其编码蛋白可形成典型的跨膜结构特征;该基因受植物激素ABA的诱导,在洛旱2号中也可被干旱、高盐和高温胁迫诱导,但在中国春中对高盐和高温胁迫无响应。推测TaPM19-1在洛旱2号和中国春中存在不同的转录调控机制。     

一个橡胶树谷胱甘肽-S-转移酶基因的克隆和表达特性分析

 【目的】从橡胶树中克隆Glutathione-S-transferase（GST）基因的cDNA和基因组DNA,进行序列、结构和系统进化分析,研究胁迫条件和激素处理下的表达谱。【方法】利用产排胶机理课题组构建的胶乳EST数据库,通过PCR技术克隆橡胶树GST基因的cDNA和基因组DNA;在线预测蛋白质保守功能域和亚细胞定位,构建系统进化树,利用实时荧光定量PCR分析割胶、伤害、低温、激素和死皮病等因素对该基因表达的影响。【结果】从橡胶树胶乳中克隆到1个GST基因的全长cDNA（793 bp）,编码25.4 kD（219aa）蛋白,命名为HbGSTU1;克隆了HbGSTU1的基因组DNA（1 313 bp）,包含1个内含子（520 bp）和2个外显子。HbGSTU1属于GST Tau家族,推测是一种无信号肽的细胞质蛋白,其N端结构域包含结合GSH的G位点,C端结构域包含特异结合底物的H位点;HbGSTU1与一个蓖麻GST蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性为85%;HbGSTU1的表达受割胶、伤害、低温、2,4-D、乙烯利和死皮病等因素调控,但对JA、SA和ABA处理的应答不明显。【结论】HbGSTU1是一个典型的GST Tau家族蛋白,可能在橡胶树抗逆过程中起作用,可作为橡胶树抗逆分子育种的靶标基因。     

独行菜抗冷相关基因的克隆及表达分析

【目的】独行菜在种子萌发和幼苗生长阶段可耐受一定程度的低温胁迫,研究独行菜的低温耐受机制。【方法】设计兼并引物,从独行菜冷诱导叶片的cDNA中克隆获得LaCBF3和LaCOR15a基因核心片段。利用半定量RT-PCR法分析两个基因在不同胁迫处理下的表达情况。【结果】获得442 bp LaCBF3及405 bp LaCOR15a核心片段,经比对与拟南芥CBF3、COR15a基因核心片段相似性分别为84.38%、81.8%。半定量RT-PCR结果显示在独行菜幼苗中,LaCOR15a基因不仅响应低温胁迫,还能迅速响应高盐、干旱及ABA处理,不同条件下表达各有差异。LaCBF3仅对低温胁迫响应迅速。【结论】LaCBF3、LaCOR15a在独行菜幼苗响应低温胁迫的分子机制中具有重要的调控作用,且LaCOR15a基因也应答干旱、高盐等非生物胁迫。     

SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导湖北海棠MhWRKY1基因的表达

 【目的】从湖北海棠叶片中克隆MhWRKY1转录因子的全长cDNA序列,分析该基因在各种组织中(叶、茎、根)的表达特性,并分析SA、MeJA、ACC在叶、茎、根中诱导MhWRKY1基因的表达模式以及苹果轮纹病病原菌诱导条件下湖北海棠叶片中该基因的表达特性。【方法】利用电子克隆技术和RT-PCR验证相结合的方法,从SA诱导的湖北海棠全长cDNA文库中,克隆MhWRKY1转录因子的全长序列;利用生物信息学的方法对其进行结构和功能的初步分析;利用实时荧光定量RT-PCR技术分析该基因在不同组织中的表达以及在SA、MeJA、ACC和苹果轮纹病病原菌诱导下的表达特性。【结果】克隆了MhWRKY1基因的全长cDNA序列为1 338 bp,GenBank数据库登录号为FJ598139。生物信息学分析表明,该基因最大开放阅读框为993 bp,编码330个氨基酸。推导的氨基酸序列与杨树WRKY26、杨树WRKY20、大豆WRKY,马铃薯WRKY2、烟草WRKY、拟南芥WRKY7、水稻WRKY53的同源性分别为68%、68%、66%、60%,59%,49%和43%。该转录因子含有1个WRKY结构域,其N端含有1个WRKYGQK结构域,C端含有1个C2H2锌脂结构,属于第Ⅱ类型的转录因子。表达分析结果表明,MhWRKY1在叶和茎中的表达量较大,分别是根的4.81和3.75倍。在湖北海棠叶、茎、根中,SA、MeJA、ACC都可以诱导该基因的表达。另外,在所研究的72 h内,苹果轮纹病病原菌可以诱导该基因表达,且表达量在12 h达到最大,是未处理之前的9倍左右。【结论】MhWRKY1转录因子可能参与SA、MeJA和ET介导的植物抗病防卫反应的基本信号通路,并且参与对苹果轮纹病病原菌引起的防卫反应,在湖北海棠的的抗病过程中可能起着非常重要的作用。