猪圆环病毒2型Cap基因原核表达载体的构建及表达

根据GenBank上已发表的PCV2的衣壳蛋白(Cap蛋白)基因设计1对引物,利用PCR方法从已知PCV2病毒中扩增到l条DNA片段,将PCR产物克隆至pMD18-T载体上获得稳定质粒,酶切及测序鉴定后,获得大小为578 bp的Cap基因序列,将该基因插入表达载体pET-30a质粒中,获得重组质粒pET-30a-PCV2-Cap,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。重组质粒pET-30a-PCV2-Cap经IPTG诱导后表达的重组蛋白分子量为28.0kD,经破碎后SDS-PAGE电泳分析表明该蛋白具有可溶性。Western blot分析表明,该重组蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

K88 ad ETEC菌毛蛋白亚基基因faeC的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为研究毒素源性大肠杆菌(ETEC)菌毛蛋白分子装配机理，从K88 ad ETEC中PCR扩增出K88菌毛蛋白小亚基基因片段facC，然后将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a( )中，获得重组质粒pET30C，并将该质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中；重组菌株经IPTG诱导后，经过SDS-PAGE分析表明该菌株可以表达FaeC蛋白(16.9kDa)，且重组蛋白主要以包涵体形式存在，约占菌体蛋白的30％。用分离纯化的重组FaeC蛋白免疫小鼠，获得FaeC的鼠抗血清，经免疫学分析表明，利用此重组蛋白制备的抗血清与FaeC重组蛋白及K88 ad ETEC的菌毛蛋白都能发生特异性抗原-抗体反应。     

大肠杆菌多重耐药调控基因marA的克隆及其原核表达

根据GenBank中大肠杆菌的marA基因序列设计引物,以大肠杆菌ATCC25922的基因组为模板,PCR扩增出约384 bp的marA基因片段,将所得片段与pMD18-T simple vector连接,转化至JM109大肠杆菌中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列测序结果与GenBank中报道一致.从阳性克隆中提取质粒,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶解,回收384 bp目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实marA基因得到表达.     

猪链球菌2型丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的鉴定和特性分析

利用PCR扩增猪链球菌2型强毒株SS2-1丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(STP)的编码基因,克隆到表达载体pET-30a(+),在大肠杆菌BL21中进行原核表达,获得重组蛋白质rSsSTP。重组蛋白质经His蛋白质层析柱纯化后,利用pNPP分析rSsSTP的酶活性。结果显示rSsSTP为Mn2+依赖的磷酸酶,最适离子浓度为2 mmol/L,最佳反应温度为37℃,最佳pH值为8.0。     

含组氨酸标签的枯草杆菌5-氨基酮戊酸脱水酶的高效表达

以枯草杆菌基因组为模板,通过PCR扩增枯草杆菌编码5-氨基酮戊酸脱水酶基因hemB.将NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切的纯化产物插入同样处理的pET-28a中构建成表达载体.表达蛋白的N端含有6个组氨酸标签.构建的表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,重组蛋白获得高效表达.SDS-PAGE检测到41 kD的特异带,表达菌株的上清检测到ALAD的比活为337 mU·mg-1,表明组氨酸标签不显著影响酶活.     

人肥胖基因大肠杆菌表达载体的构建及其诱导表达

通过设计1对PCR引物（上游引物,5-′GCCATATGGTGCCGATCCAAAAAG-3′,下游引物,5-′GAGAATTCCCTTCAAGGCCTCAG-3′）,采用PCR方法扩增出人肥胖基因编码成熟肽的核苷酸序列,将扩增产物从琼脂糖凝胶上回收后插入测序载体pMD-18-T后进行了核苷酸序列测定。将经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的扩增产物插入经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的大肠杆菌表达载体pET-28a（＋）,构建了可在大肠杆菌中高效表达人瘦蛋白的表达载体。将表达载体转化入大肠杆菌菌株BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果表明构建的人肥胖基因表达载体得到高效表达,重组蛋白占到菌体总蛋白的31.2%。     

乳酸克鲁维斯酵母乳糖酶基因的克隆及原核表达

从乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k538中克隆获得乳糖酶基因klac,并将其插入到表达载体pET-30a( )上构建重组表达质粒pETlac4。将pETlac4电击转化到大肠杆菌BL21中,分别研究了阳性转化子在28℃,37℃下经IPTG诱导3h后的蛋白表达情况。表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明,k／ac基因在大肠杆菌中获得活性表达,其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃,28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0、475U／mL,37℃仅为0．134U／mL。     

西农萨能羊凝乳酶原基因的克隆与原核表达

【目的】克隆西农萨能羊凝乳酶原基因并进行原核表达,对表达产物凝乳酶原复性后进行活性检测,为西农萨能羊凝乳酶制剂的微生物发酵生产奠定基础。【方法】从西北农林科技大学西农萨能羊原种场新生公羔羊的皱胃组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶基因全长编码区序列。将该基因连接到原核表达载体pET-30a中,构建重组菌pET-30a/Chymosin,经酶切、测序鉴定后进行凝乳酶的小量表达、大量表达、Western杂交鉴定、纯化、复性和活性测定。【结果】通过RT-PCR方法获得了西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,并构建了重组菌pET-30a/Chymosin;通过体外原核表达获得了西农萨能羊凝乳酶原,将酶原进行复性后测得重组菌酶活力为93.2U/mL。【结论】利用西农萨能羊凝乳酶原基因,通过构建原核表达载体和体外表达可以得到凝乳酶原,通过蛋白纯化和复性可得到有活性的凝乳酶。     

水稻HL-CMS中线粒体基因orf216原核表达载体构建及蛋白纯化

将orf216基因克隆到含有组氨酸标签的原核表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒pET-30a(+)-orf216,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plys菌株感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。通过Ni-NTA亲和层析系统纯化获得高纯度目的蛋白。研究结果表明,成功构建了pET-30a(+)-orf216原核表达载体并转化大肠杆菌。SDS-PAGE和Western Blot结果显示30 ku处有单一条带,确定其能高效表达并且诱导表达产物为ORF216蛋白。同时对利用Ni-NTA层析系统纯化高纯度高含量ORF216融合蛋白的条件进行了优化。     

猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.     

狂犬病病毒HEP-Flury株N基因的修饰及原核表达

为了高效表达狂犬病病毒HEP-Flury的核蛋白,选取抗原决定簇富集区,利用生物信息学技术分析了狂犬病病毒HEP-Flury N蛋白的核苷酸序列.根据大肠埃希菌Escherichia coli对密码子的偏嗜性,首先对所选取的核苷酸序列进行修饰、引入酶切位点,然后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-NP.将其转化表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysS,以IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量34 000处有1条特异的蛋白带,与预期大小一致.Western-blotting检测结果显示,该蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及犬抗RV多克隆抗体特异识别,表明所表达的N蛋白具有良好的免疫原性.     

利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究

利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

蜱传脑炎病毒E基因的重组质粒构建及其在原核细胞的表达

通过表达蜱传脑炎病毒E蛋白,为制备蜱传脑炎快速检测试纸条的奠定基础。根据GenBank数据库中已发表的蜱传脑炎病毒的基因序列,检索并合成蜱传脑炎病毒目的基因E,设计引物,PCR扩增,克隆至原核表达载体pET-30a(+)构建重组质粒,在BL21细菌内表达蜱传脑炎病毒E蛋白。结果表明:经过PCR试验和双酶切试验鉴定,克隆测序正确,通过重组质粒,成功地表达出蜱传脑炎病毒E蛋白。     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3的克隆与原核表达

根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓形虫MIC3蛋白的高度保守性;构建的原核细胞表达质粒PET-MIC3表达产物分子量为46 ku,且经Western-blot显示可被猪抗弓形虫免疫血清识别.     

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30基因的克隆及原核表达

以载有银田牌长白苦瓜MAP30基因(YT-MAP30,Genebank accession No:DQ643968)的质粒DNA(pMD-YT-MAP30)为模板,PCR扩增其成熟肽编码区YTm-MAP30,与原核表达载体pET-30a(+)连接构建重组表达质粒pET-YTm-MAP30,酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS感受态细胞,菌落PCR筛选鉴定阳性菌落。30℃培养阳性菌落,IPTG诱导表达不同时间,其表达产物用SDS-PAGE检测并进行可溶性分析。DNA测序结果表明重组质粒pET-YTm-MAP30中YTm-MAP30的序列和插入位点正确。SDS-PAGE分析结果显示IPTG诱导4 h后在35 kD处出现一条增加的表达蛋白条带,且以可溶形式表达。为应用原核表达系统生产MAP30蛋白提供了实验依据。     

抗菌肽MagaininⅡ的原核表达与抗菌活性分析

根据MagaininⅡ氨基酸序列,选用大肠杆菌偏爱密码子,化学合成了2个DNA片段,利用重叠区互补PCR法得到MagaininⅡ的基因序列.构建了融合表达载体pET21 b-MagaininⅡ,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在5.1 kD处可见目的蛋白条带,...     

双歧杆菌对病原菌粘附肉鸡肠粘液的影响

研究两歧双歧杆菌、禽大肠杆菌O78、大肠杆菌ATCC25922、鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌与肉鸡不同肠段粘液糖蛋白的粘附性能，探讨两歧双歧杆菌对四种病原菌的粘附排斥作用。结果表明，在不同的肠道部位，两歧双歧杆菌、鸡白痢沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌与肠粘液糖蛋白的粘附能力不同，而禽大肠杆菌O78、大肠杆菌ATCC25922在各肠段粘液上的粘附性能相近；在相同的肠道部位，所试菌与肠粘液糖蛋白的粘附能力有差异，其中两歧双歧杆菌的粘附作用最强；肠粘液糖蛋白经两歧双歧杆菌处理后，禽大肠杆菌O78、大肠杆菌ATCC25922和鸡白痢沙门氏菌的粘附作用受到抑制，而鼠伤寒沙门氏菌在十二指肠、空肠粘液上的粘附率未见下降。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp7蛋白的表达与纯化

为了解nsp7重组蛋白的免疫学活性,采用RT-PCR的方法从猪繁殖与呼吸道综合症病毒(PRRSV)BJ-4毒株中扩增得到nsp7基因,将基因连接到pET-28a载体并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,利用Ni-NTA进行亲和纯化,通过SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行分析和鉴定,通过间接ELISA方法研究了重组蛋白的免疫学活性。结果表明,成功制备了nsp7重组蛋白,间接ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,为建立nsp7特异性抗体的间接ELSIA检测方法及PRRS诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

鸭新城疫病毒M基因的原核表达与多抗制备

为制备鸭源新城疫病毒M蛋白的多克隆抗体,根据鸭新城疫病毒M基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出M基因,克隆入原核表达载体p ET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下成功表达重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为39 ku。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备重组蛋白的多抗血清,Western blot分析显示,制备的多抗血清能与鸭新城疫病毒感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,M基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的鼠多抗血清可以用于M蛋白的检测。