水稻3-磷脂酰肌醇激酶FAB1/PIKfyve基因家族的鉴定及功能分析

FAB1/PIKfyve是催化3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)形成3,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns(3,5)P2)过程的关键酶,其产物PtdIns(3,5)P2在真核细胞发育中发挥重要功能.为探寻PtdIns(3,5)P2在水稻生殖发育过程中的功能,本研究结合生物信息学和遗传学方法,对水稻FAB1/PIKfyve基因进行鉴定,分析其理化性质、基因结构、保守结构域、系统进化、顺式作用元件和组织表达模式并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得osfab1b突变体.生物信息学分析结果显示,水稻基因组中共鉴定到9个FAB1基因家族成员;基因结构分析显示FAB1家族基因结构存在差异,外显子数量为8～12个;保守结构域分析表明仅OsFAB1A和OsFAB1B含有N端FYVE结构域,其余成员具有Cpn60_TCP1结构域和PIPKc激酶结构域;系统进化分析提示FAB1家族功能在单双子叶植物中具有高度保守性;FAB1基因上游调控区域顺式元件预测发现多种生长发育相关、光响应以及激素和胁迫响应顺式元件;组织表达模式分析显示大多数FAB1基因为泛表达,其中FAB1C亚类基因在内外稃中的高表达提示其可能参与花器官发育.最后通过CRISPR/Cas9系统得到osfab1b突变体,经碘染观察花粉活力无明显异常,暗示FAB1家族在水稻生殖发育调控中存在功能冗余.本研究结果为单子叶模式植物水稻中磷脂酰肌醇调控网络及其生物学功能的研究提供了理论参考.     

花药绒毡层细胞程序性死亡研究进展

绒毡层作为花药壁最内层的特殊体细胞，与小孢子母细胞以及花药发育后期的小孢子直接相互作用，在花粉发育过程中起着至关重要的作用。花药绒毡层发育到一定阶段，绒毡层细胞需要经过一个细胞程序性死亡的降解过程为小孢子的发育提供营养和物质保证，而且绒毡层细胞降解的提前或者延迟都将导致雄性不育。近年来人们利用分子生物学手段已相继克隆到了一些与绒毡层细胞程序性死亡相关的基因，使人们对绒毡层的降解机制有了更深入的认识。本文旨在综述花药绒毡层细胞程序性死亡特征及其调控机制研究的最新进展。     

水稻减数分裂异常突变体osmd的表型分析及基因定位

减数分裂是有性生殖生物繁殖的基础,减数分裂和受精过程的正常进行保证了有性生殖生物配子体和合子体世代交替,并维持了遗传物质的稳定性。因此发现和克隆减数分裂相关基因可为进一步理解减数分裂调控过程提供研究基础。通过正向遗传学方法,筛选一个水稻减数分裂相关突变体并将其命名为osmd(Oryza sativa meiosis defect)。对其生长过程、花器官、花粉育性进行观察分析;通过DAPI,FISH染色对其进行染色体行为分析;并对该突变体进行遗传分析、基因定位和候选基因分析。结果表明,与野生型相比,osmd突变体营养生长过程正常,花器官以及雌蕊形态正常,但是成熟期花药不饱满,花粉粒不能被I2-KI染色。对突变体osmd花粉母细胞减数分裂过程观察发现,在粗线期染色体不能完全配对、终变期出现单价体、二分体时出现滞后染色体、四分体时期出现多个微核。通过FISH试验确定osmd突变体同源染色体不能正常配对。遗传学分析表明,osmd突变体不育表型由一个单核隐性基因控制;通过图位克隆将osmd的突变位点定位到10号染色体上的2个Indel分子标记Chr10-312和Chr10-1003-3之间,该区间共有900 kb,有133个开放阅读框。该区间内一个已知水稻减数分裂相关基因OsPAIR3编码区序列无变化。由此推测Os MD是一个未报道的参与水稻减数分裂同源染色体配对过程的蛋白。     

水稻半胱氨酸蛋白酶OsCP2的特征分析及其原核表达与纯化

半胱氨酸蛋白酶是植物体中重要的蛋白水解酶,广泛参与种子萌发、幼苗发育、胁迫响应和组织分化衰老等生理过程.我们对水稻中半胱氨酸蛋白酶基因OsCF2 (Oryza sativa cysteine protease 2)序列进行分析.该基因cDNA全长2 279 bp,由2个外显子和1个内含子组成;包含1个1 089 bp的开放读码框,编码1个含362个氨基酸残基的蛋白,在蛋白氨基端有-36个氨基酸组成的信号肽.生物信息学分析表明,OsCP2与大麦半胱氨酸蛋白酶HvCP同源性最高,同属木瓜蛋白酶亚家族.另外,我们构建了pET32a/CP2原核.表达载体,通过转化大肠杆菌BL21DE3,成功表达了OsCP2重组蛋白.分子量约为58kD;通过纯化包涵体获得了纯度高达90%以上的重组OsCP2蛋白,这为进一步研究该基因的功能提供了基础.     

杂交粳稻亲本随机扩增多态性DNA（RAPD）分析（研究简报）

选用60个随机引物对15份杂交粳稻亲本材料进行了RAPD分析，其中10上物的扩增结果具有明显的多态性。在这15份杂交粳稻亲本材料中共扩增得到153条条带，其中的86条为多态性条带。聚类分析结果表明，所有供试验材料可以被明确分区，在此基础上分析了这15个水稻品种的亲缘关系，对田间育种有一定的参考价值。     

利用高效农杆菌遗传转化系统将ACP反义基因片段导入油菜

通过对已有的油菜农杆菌遗传转化体系的改进，建立了一种利用农杆菌感染油菜子叶柄的高效遗传转化方法，经过农杆菌感染的子叶柄在含有6-BA2．0mg／L，IBA0．15mg／L，AgNO33．5mg／L的MS培养基上由卡那霉素抗性愈伤组织分化出抗性幼苗的频率达到12．28％。利用已经构建的含有油菜Napin启动子加上反义ACP脱饱和酶第一外显子、内含子的基因片段的植物双元表达载体pNACP，将该反义ACP基因片段转入油菜“沪油15”；PCR和GUS染色结果表明抗性植株中有60％的植株含有导入的目的基因。这为油菜籽脂肪酸遗传改良提供了一种新的方法。     

K88 ad ETEC菌毛蛋白亚基基因faeC的克隆、表达及多克隆抗体的制备

为研究毒素源性大肠杆菌(ETEC)菌毛蛋白分子装配机理，从K88 ad ETEC中PCR扩增出K88菌毛蛋白小亚基基因片段facC，然后将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a( )中，获得重组质粒pET30C，并将该质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中；重组菌株经IPTG诱导后，经过SDS-PAGE分析表明该菌株可以表达FaeC蛋白(16.9kDa)，且重组蛋白主要以包涵体形式存在，约占菌体蛋白的30％。用分离纯化的重组FaeC蛋白免疫小鼠，获得FaeC的鼠抗血清，经免疫学分析表明，利用此重组蛋白制备的抗血清与FaeC重组蛋白及K88 ad ETEC的菌毛蛋白都能发生特异性抗原-抗体反应。     

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得水稻OsWOX9C基因突变体

WUSCHEL-Related HOMEOBOX(WOX)基因家族是植物所特有的一类转录因子基因家族,该家族成员在植物发育的不同过程中发挥了重要的调节功能。相比于双子叶模式植物拟南芥,对于单子叶模式植物水稻中WOX基因家族成员功能的了解还很不充分。水稻DWT1/OsWOX9隶属于WOX基因家族的中间支,该基因在水稻主穗和分蘖穗的协同生长中起到了重要的调节作用。OsWOX9B和OsWOX9C是水稻中与DWT1/OsWOX9最为同源的基因,并具有相似的表达模式,但是否具有相似的生物学功能尚不清除。为了研究水稻WOX基因家族成员OsWOX9C的功能,我们利用CRISPR-Cas9基因编辑体系,设计了水稻WOX家族基因OsWOX9C(LOC_Os05g48990)的敲除靶点,构建了OsWOX9C基因的敲除载体。通过对OsWOX9C基因序列分析,将合成的靶点序列插入p BIN-sg R-Cas9-Os载体中,构建p BIN-sg R-Cas9-Os-Target载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻品种9522。从5株T0代转基因苗中鉴定出1株OsWOX9C突变的杂合突变体,并通过对自交分离群体的测序分析,筛选出OsWOX9C的四种突变类型。这四种突变体的突变位点均在外显子第146位碱基处,包括插入碱基A或T的两种纯合突变类型,以及插入A/T或C/T的两种双等位突变类型。通过蛋白序列分析,发现这四种突变株系均导致移码而使氨基酸提前终止致使基因突变。本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得了水稻OsWOX9C基因的敲除突变体,为进一步研究OsWOX9C基因的功能提供了重要的遗传材料。     

转基因抗草甘膦油菜的实用PCR检测方法

 利用定性PCR技术 ,建立了检测孟山都公司培育的转基因抗草甘膦油菜中的epsps、gox和fmv35s的方法 ,同时设立了阳性内对照napin。该方法的检测灵敏度为 0 .0 5 %。利用复合PCR可以在一个PCR反应中同时检测出epsps、gox、fmv35s和napin基因。这种方法可以有效地用于转基因抗草甘膦油菜中的外源基因的检测。     

光受体基因在19种水稻品种中的序列多态性分析

光周期途径是控制水稻抽穗期的主要途径,而光敏色素和隐花色素是植物体内感受光照和控制开花的主要光受体。在驯化过程中,水稻在长期的人工选择下形成了地域分布和抽穗期各异的地方品种,为了了解这些地方品种对日长响应的分子基础,对19种水稻品种(11种籼稻和8种粳稻)中5种主要的光受体OsPHYA、OsPHYB、OsCRY1a、OsCRY1b及OsCRY2基因编码区序列的多态性进行了分析。结果共发现了23个核苷酸多态位点,其中11个位点引起了氨基酸的变化。OsPHYB和OsCRY2相比于其他基因表现出更高的序列多态性,说明这2个基因可能是人工选择过程中影响水稻抽穗期的重要靶点。