鞭毛蛋白及鸡GM-CSF重组新城疫病毒对鸡的免疫增强作用

为评价鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)以及鸡GM-CSF(chGM-CSF)对新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗的免疫增强效果,本实验通过PCR扩增fliC,并合成chGM-CSF编码基因,分别构建重组质粒pBrClone30-fliC和pBrClone30-GM-CSF,拯救获得重组病毒rClone30-fliC和rClone30-GM-CSF。RT-PCR和ELISA检测结果表明:fliC和chGM-CSF基因正确插入重组病毒,并获得稳定表达;重组病毒免疫7 d后重组NDV HI抗体效价检测显示,实验组平均HI效价分别达到4.5 log2和4.8 log2,而r Clone30组和空白组HI效价仅为3 log2和1 log2;免疫7 d后攻毒,空白组SPF鸡均死亡,rClone30组有两例发病,实验组SPF鸡全部存活并且无任何临床症状。本研究结果表明,FliC和chGM-CSF作为佐剂能够有效提高弱毒疫苗的免疫效果。     

FGF-21对大鼠血小板聚集和活化的抑制作用

临床上大部分抗血小板药物存在继发性出血等副作用,亟需寻找一种安全有效的抗血小板药物。二磷酸腺苷(ADP)和花生四烯酸(AA)是介导血小板聚集的主要物质,文章探讨成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是否抑制ADP或AA诱导大鼠血小板聚集和活化。将大鼠分为正常对照组、正常鼠血小板活化组、阿司匹林干预后血小板活化组、FGF-21高、中、低剂量干预后血小板活化组。给药干预后提取各组血小板,分别用ADP或AA处理,观察处理后血小板聚集情况以及P选择素和血栓素(TXB2)表达水平。与正常对照组相比,正常鼠血小板经ADP或AA处理活化后,血小板聚集率显著升高,血浆中P选择素和TXB2含量明显上升;与正常鼠血小板经ADP或AA处理活化后相比,经阿司匹林和FGF-21干预后分别经ADP或AA处理活化后的血小板聚集率显著下降,血浆中P选择素和TXB2含量显著下降;FGF-21干预组经ADP或AA活化后,血小板聚集率、P选择素和TXB2含量下降水平呈明显剂量依赖性。目前国内外尚未发现FGF-21对血小板聚集与活化作用的相关报道,研究首次证明FGF-21具有抑制ADP和AA诱导血小板聚集和活化作用及明显的抗血凝作用,填补FGF-21在抗血凝研究领域空白,为开发安全有效的抗血凝药物提供理论依据。     

与大豆疫霉根腐病抗性基因Rps1-c连锁的分子标记研究

以大豆疫霉根腐病近等基因系Williams和Williams79为材料,对它们的基因组DNA进行RAPD分析,160个10-nt随机引物中,只有引物OPQ-04在Williams79中扩增出特异条带,在Williams中未扩增出,且3次重复均获得一致结果。经进一步检测在其它抗病材料中也出现该特异条带,推测该特异条带与大豆抗疫霉根腐病抗性基因Rps1-c连锁,得到显性RAPD标记OPQ-04700。     

犬干扰素-γ的可溶表达及其产物的活性鉴定

为研究犬干扰素-γ(CaⅢN-γ)的可溶表达,本研究应用SUMO表达系统高效稳定、可溶地表达了SUMO-CaIFN-γ蛋白.以MDCK细胞为靶细胞,MTT法检测CaIFN-γ对该细胞增殖的抑制作用.结果表明,CaIFN-γ对MDCK具有明显的抑制作用.Real time法检测CaIFN-γ刺激MDCK细胞后,细胞内源p53 mRNA水平的变化,结果显示,p53的表达量与CaIFN-γ的剂量和时间呈依赖性关系.本研究为进一步研究CaIFN-γ的生物学特性、研制新型CaIFN-γ用于我国犬类疾病的治疗及CaIFN-γ生物制剂的生产奠定了基础.     

基于内部核糖体进入位点提高重组NDV表达IBDV VP2基因的研究

为提高重组新城疫病毒(NDV)外源基因表达量,本研究采用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV) HLJ07株VP2双拷贝基因的重组NDV(rClone30-VP2-IRES-VP2),同时构建表达单拷贝VP2基因的重组NDV (rClone30-VP2)作为对照.间接免疫荧光试验表明VP2蛋白在感染两种重组病毒的鸡胚成纤维细胞(DF-1)中得到表达.Real-time PCR检测结果表明rCIone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2.生长曲线分析表明,两株重组病毒株与亲本NDV LaSota (Clone30)株在细胞培养中可以同样稳定复制.重组病毒株在鸡胚中多次传代之后仍稳定表达VP2蛋白.本研究通过建立NDV的反向遗传操作系统构建了独立表达IBDV双拷贝VP2基因的重组NDV,并证明双拷贝基因的表达水平优于单拷贝基因,为提高重组NDV外源基因的表达量提供了新的思路.     

近60年河西走廊绿洲农作区近地面水汽变化特征分析

根据河西走廊地面气象观测时间最长的敦煌、瓜州、玉门、酒泉、高台、张掖、山丹、武威、民勤9个站的水汽压观测资料,运用线性回归、小波和Mann-Kendall方法对绿洲农作区近地面水汽变化特征进行趋势、周期及突变分析。结果表明：近60 a河西走廊绿洲农作区近地面水汽均呈波动上升趋势,线性递增率为0.123 hPa·10a^-1。夏、秋两季上升幅度最大,线性递增率分别为0.192 hPa·10a^-1和0.198 hPa·10a^-1, 春季递增率仅为0.056 hPa·10a^-1属最小;年水汽变化存在3 a主周期和30 a较长主周期,还有10 a较弱周期。春、夏季水汽变化有5 a主周期和20～30 a左右的较长周期尺度;秋季水汽变化有5 a主周期,还存在30～40 a长周期;冬季水汽变化存在5 a周期,随着时序延长,周期也在延长,2000年以后有15 a周期。年水汽含量在1985年出现突变;春季水汽含量在1980年出现突变;夏季水汽含量在1986年出现突变;秋季水汽含量1994年出现突变;冬季水汽含量在1983年出现突变。水汽含量对气候变暖响应明显,年、季水汽压与平均气温之间相关显著,年平均、春、夏、秋、冬季相关系数分别为0.592、0.192、0.551、0.532、0285。说明河西走廊年、夏、秋、冬季近地面水汽变化与河西走廊平均气温有显著正相关。     

SUMO-cFGF-21发酵工艺优化及其降糖效果研究

研究旨在优化SUMO-cFGF-21发酵工艺,同时检测cFGF-21蛋白对糖尿病小鼠和犬血糖的降糖效果。通过SDS-PAGE电泳分析发酵条件(菌种、工程菌OD600、诱导时间、诱导温度、诱导剂IPTG浓度)对SUMOcFGF-21蛋白表达的影响。结果表明,22号菌种蛋白表达量最高,达到上清蛋白30.5%,可作为一级菌种。发酵过程中,当工程菌OD600值约为2、诱导时间6 h、诱导温度23℃、诱导剂IPTG终浓度1 mmol·L~(-1)时,上清中SUMOcFGF-21蛋白表达量最高,达到上清蛋白19.7%。经Ni柱亲和层析,酶切去掉SUMO标签后成功制备cFGF-21蛋白。将不同剂量cFGF-21持续注射糖尿病小鼠两周,以有效剂量cFGF-21持续注射糖尿病犬两周,观察降糖效果。结果表明,与模型对照组相比,有效剂量cFGF-21均可极显著降低糖尿病小鼠和犬的血糖(P0.01)。研究成功优化SUMO-cFGF-21蛋白中试发酵工艺,并检测cFGF-21蛋白对糖尿病小鼠和犬血糖的降糖效果,为临床应用cFGF-21治疗犬糖尿病提供依据。     

鸭α-干扰素在昆虫细胞中的表达

干扰素（Interferon，IFN）是活细胞在病毒或其他干扰素诱生剂作用下产生的一种糖蛋白，当它进入未感染的细胞时，可诱导该细胞产生抗病毒蛋白质，从而抑制其他病毒在该细胞中的复制。干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能作用。无论哺乳类还是禽类，干扰素都有两大类型，即Ⅰ型（主要是α和β）和Ⅱ型（γ）干扰素。其中α干扰素（IFN-α）由白细胞产生。Ⅰ型于扰素的抗病毒作用最强，主要是通过旁分泌发挥作用。     

利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究

利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。     

利用SUMO表达系统高效可溶性表达鸡传染性法氏囊病病毒VP3基因

为评价SUMO原核表达系统(pHisSUMO Express)对病毒基因的可溶性表达,本研究从人工接种发病的鸡传染性法氏囊病(IBD)的病料组织样品中提取总RNA,通过RT-PCR扩增IBD病毒(IBDV)VP3基因,并将其克隆于pHisSUMO中构建了重组表达质粒pHisSUMO-VP3,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)PlysS,经IPTG诱导,得到可溶性表达的融合蛋白SUMO-VP3。结果表明,该融合蛋白表达量占细菌总蛋白35%,经HisTrapTMFF crude column层析柱纯化后的SUMO-VP3蛋白可被SUMO蛋白酶Ⅰ有效切割,获得无标签的VP3蛋白,经western blot鉴定表明该VP3蛋白具有良好的抗原性。本研究表明pHisSUMO Express表达系统是高效可溶表达外源蛋白的有效工具,所表达的病毒蛋白具有良好的抗原性,为病原诊断抗原的研究和制备提供有效表达系统。