鞭毛蛋白及鸡GM-CSF重组新城疫病毒对鸡的免疫增强作用

为评价鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(FliC)以及鸡GM-CSF(chGM-CSF)对新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗的免疫增强效果,本实验通过PCR扩增fliC,并合成chGM-CSF编码基因,分别构建重组质粒pBrClone30-fliC和pBrClone30-GM-CSF,拯救获得重组病毒rClone30-fliC和rClone30-GM-CSF。RT-PCR和ELISA检测结果表明:fliC和chGM-CSF基因正确插入重组病毒,并获得稳定表达;重组病毒免疫7 d后重组NDV HI抗体效价检测显示,实验组平均HI效价分别达到4.5 log2和4.8 log2,而r Clone30组和空白组HI效价仅为3 log2和1 log2;免疫7 d后攻毒,空白组SPF鸡均死亡,rClone30组有两例发病,实验组SPF鸡全部存活并且无任何临床症状。本研究结果表明,FliC和chGM-CSF作为佐剂能够有效提高弱毒疫苗的免疫效果。     

新城疫病毒疫苗株F蛋白裂解位点改造对诱导HepG2细胞发生自噬的影响

新城疫病毒(NDV)通过启动不依赖p53的内源性凋亡通路特异性诱导肿瘤细胞凋亡.最新研究表明NDV可以引起U251肿瘤细胞发生自噬,并在后期导致细胞凋亡,但其机理尚不清楚.本研究通过反向遗传操作技术对NDV Clone30疫苗株F蛋白的碱性裂解位点进行突变,将F蛋白的裂解位点由弱毒株的GGRQGR ↓ L突变为强毒株的GRRQRR ↓ F基序,并成功拯救出突变改造病毒rC30-FmF.分别将Clone30野生型病毒株rC30-wt与rC30-FmF感染HepG2肝癌细胞,通过透射电镜检测细胞超微结构显示,rC30-FmF感染4h后细胞内出现大量自噬小体及自噬溶酶体.通过westem blot检测自噬标志蛋白LC-3 Ⅱ表明,rC30-FmF感染4h后LC3Ⅱ表达量显著上调,与rC30-wt对照组相比差异极显著(p＜0.01).研究表明,rC30-FmF可以在感染早期增加HepG2细胞自噬程度.从而初步证明F蛋白的裂解位点在诱导HepG2细胞自噬过程中具有关键作用.     

蛋白质组学与药学研究

人类基因组计划在20世纪90年代初开始启动。随着这一计划的提前完成,生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学,人们的生活也将随之发生巨大的变化。蛋白质组学与药学的学科交叉也形成了新的研究领域——药物蛋白质组学,其研究内容包括:(1)发现药物作用靶点以及针     

基于内部核糖体进入位点提高重组NDV表达IBDV VP2基因的研究

为提高重组新城疫病毒(NDV)外源基因表达量,本研究采用内部核糖体进入位点序列(IRES)构建表达鸡传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV) HLJ07株VP2双拷贝基因的重组NDV(rClone30-VP2-IRES-VP2),同时构建表达单拷贝VP2基因的重组NDV (rClone30-VP2)作为对照.间接免疫荧光试验表明VP2蛋白在感染两种重组病毒的鸡胚成纤维细胞(DF-1)中得到表达.Real-time PCR检测结果表明rCIone30-VP2-IRES-VP2中VP2 mRNA转录水平明显高于rClone30-VP2.生长曲线分析表明,两株重组病毒株与亲本NDV LaSota (Clone30)株在细胞培养中可以同样稳定复制.重组病毒株在鸡胚中多次传代之后仍稳定表达VP2蛋白.本研究通过建立NDV的反向遗传操作系统构建了独立表达IBDV双拷贝VP2基因的重组NDV,并证明双拷贝基因的表达水平优于单拷贝基因,为提高重组NDV外源基因的表达量提供了新的思路.     

携带CD自杀基因NDV重组病毒对小鼠肝癌细胞转移模型的治疗效果

采用反向遗传操作技术构建新城疫病毒基因组NP/P位点表达胞嘧啶脱氨酶(Cytosine deaminase,CD)基因弱毒力重组新城疫病毒rClone30-CD和中毒力重组新城疫病毒rAnhinga-CD。MTT检测结果表明,在协同5-氟胞嘧啶(5-Fluorocytosine,5-FC)条件下,两株重组新城疫病毒可在体外有效杀伤人肝癌细胞HepG2。通过Balb/c鼠尾静脉注射小鼠肝癌细胞H22构建小鼠肝癌细胞转移模型,经重组病毒协同5-FC联合治疗,荷瘤小鼠转移肿瘤体积显著缩小、肿瘤组织出现明显凋亡与坏死。体内试验结果表明,中毒力重组新城疫病毒rAnhinga-CD抑瘤效果优于弱毒力重组新城疫病毒r Clone30-CD。     

计算机网络数据库在禽病防制中的应用

随着我国规模化、集约化养禽业的发展,养禽业传染病的综合防制成了保障其健康发展的重要因素之一.在贯彻"预防为主,防重于治"的综合防疫措施基础上,进一步健全和完善禽病防疫体系,加强禽病诊断、防治技术的研究和科技成果的推广已成为客观需求.本文利用计算机网络数据库技术进行禽病专家系统的设计,采用临床诊断结合流行病学和病理学诊断技术来确诊疾病,以及提供禽病综合防制措施及相关内容的查询,为养禽业提供一定的禽病诊断、防制支撑和政策指导,保障我国养禽业进一步健康发展.     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力

利用DNA重组技术，将编码猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）TH-98株的全长S基因和主要抗原位点的Sa片段分别插入真核表达载体pCI的多克隆位点中。应用酶切、PCR方法鉴定阳性重组子pCI—Sa和pCI—S。将昆明鼠随机分成A、B、C3组（A组为pCI—Sa免疫组、B组为pCI-S免疫组、C组为pCI栽体对照组），每组35只，每只鼠肌肉注射100μg，免疫3次，每次间隔2周。于初次免疫后第0、14、21、28、35、42d采血，用ELISA检测血清抗体动态变化，流式细胞仪检测外周血CD4^＋和CD8^＋T细胞数量变化。结果表明，重组真核表达栽体均能诱导免疫鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答，而且pCI—Sa的免疫效果优于pCI-S。     

利用SUMO表达系统高效可溶性表达鸡传染性法氏囊病病毒VP3基因

为评价SUMO原核表达系统(pHisSUMO Express)对病毒基因的可溶性表达,本研究从人工接种发病的鸡传染性法氏囊病(IBD)的病料组织样品中提取总RNA,通过RT-PCR扩增IBD病毒(IBDV)VP3基因,并将其克隆于pHisSUMO中构建了重组表达质粒pHisSUMO-VP3,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)PlysS,经IPTG诱导,得到可溶性表达的融合蛋白SUMO-VP3。结果表明,该融合蛋白表达量占细菌总蛋白35%,经HisTrapTMFF crude column层析柱纯化后的SUMO-VP3蛋白可被SUMO蛋白酶Ⅰ有效切割,获得无标签的VP3蛋白,经western blot鉴定表明该VP3蛋白具有良好的抗原性。本研究表明pHisSUMO Express表达系统是高效可溶表达外源蛋白的有效工具,所表达的病毒蛋白具有良好的抗原性,为病原诊断抗原的研究和制备提供有效表达系统。     

表达鸡IL2和IL15重组新城疫病毒的免疫增强作用研究

为提高新城疫病毒(NDV)弱毒疫苗的免疫保护效果,本研究选取鸡IL2(chIL2)和chIL 15两个细胞因子作为分子佐剂,通过反向遗传操作技术分别将这两个基因克隆于NDV Clone30株中,构建表达chIL2和chIL15的重组病毒rClone30-chIL2和rClone30-chIL15.ELISA法检测结果表明两种细胞因子在重组病毒中均能够稳定表达.将重组病毒免疫雏鸡,以NDV强毒BJ株进行攻毒试验,测定其抗体产生情况和保护效果.结果表明,两种重组病毒均可以诱导雏鸡产生较高水平抗体;而且两种重组病毒保护率可达100％,具有较好的保护效果.本研究为进一步提高NDV重组基因工程疫苗的效果提供了新思路.     

利用反向遗传操作技术拯救重组新城疫病毒

将新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Anhinga株的全长cDNA的克隆质粒以及L、P、NP的表达质粒共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救病毒。通过RT-PCR扩增、酶切鉴定、测序验证拯救病毒中分子标签的存在,并通过血凝试验测定病毒的血凝效价、测定蚀斑形成单位确定病毒滴度,从而证明病毒拯救成功。新城疫病毒Anhinga株的拯救成功为该病毒进行结构基因研究和疫苗研制奠定了基础。