改进V形孔培养法对牛胚胎体外生产效果的影响

【目的】探索V形孔培养法(WOW)、改进V形孔培养法(mWOW)和常规微滴培养法对牛胚胎体外生产效果的影响。【方法】将牛卵母细胞和受精卵分别采用常规微滴培养法(对照组)、WOW和mWOW进行体外培养,对照组每个微滴中置入20～25枚卵母细胞或胚胎,WOW和mWOW组每个V形孔中置入1枚卵母细胞或胚胎,计算卵裂率、囊胚率及受精后第6,7,8天的囊胚总细胞数和囊胚孵化率。【结果】mWOW组的卵裂率、囊胚率及第6,7,8天囊胚的总细胞数、囊胚孵化率与常规微滴组差异不显著(P0.05),但显著高于WOW组(P0.05);3个组第6,7,8天获得的囊胚总细胞数均呈逐渐下降的趋势。【结论】以TCM-199为基础培养液,用mWOW可以完成牛胚胎体外生产的全过程,且比WOW培养胚胎具有更强的发育能力和更好的质量。体外培养时,发育越快的胚胎质量越高。     

牛卵胞质内显微受精中第一极体位置与激活方法研究

【目的】探讨牛卵母细胞胞质内显微受精(ICSI)操作中,卵母细胞第一极体位置以及受精卵化学激活方法对ICSI卵体外发育的影响。【方法】采集牛卵巢,成熟培养卵母细胞后,调整其第一极体分别位于相当于时钟6点和12点的位置,进行牛卵母细胞胞质内显微受精,以ICSI卵不进行激活处理为未激活组,分别采用乙醇、离子霉素及离子霉素联合6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)激活ICSI卵,统计ICSI卵的形态完整率、卵裂率和囊胚发育率。【结果】第一极体分别位于相当于时钟6点和12点的位置时,所获得的ICSI卵形态完整率(92.9%和94.0%)、卵裂率(37.1%和40.0%)和囊胚发育率(12.9%和12.2%)均无统计学差异(P>0.05)。未激活组ICSI卵的卵裂率较低,不能发育到囊胚;用乙醇或离子霉素激活时,ICSI卵的卵裂率(25.7%和27.6%)和囊胚发育率(3.3%和3.4%)均显著高于未激活组(7.5%和0)(P<0.05);用离子霉素与6-DMAP联合激活时,ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率分别为38.9%和13.9%,显著高于乙醇激活组、离子霉素激活组及未激活组(P<0.05)。【结论】对牛卵母细胞进行ICSI操作时,第一极体分别位于相当于时钟6点和12点位置时,对ICSI卵的发育无显著影响;采用离子霉素和6-DMAP联合激活,有利于ICSI卵的体外发育。     

生长因子和体细胞共培养对牛体外受精的影响

为研究表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对牛卵母细胞体外发育的影响以及体细胞共培养对体外受精胚胎体外发育的影响,将获取的牛卵泡卵母细胞在含有30μg,LEGF或50mg／L Insulin或30μg／LEGF＋50mg／L Insulin的成熟培养液中进行成熟培养,比较不同生长因子对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响;将受精卵用颗粒细胞单层培养系统或牛输卵管上皮细胞单层培养系统进行体外培养,比较体细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30μg／LEGF或者30μg／LEGF＋50mg／L Insulin可以显著提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率（P〈0．05）;输卵管上皮细胞共培养系统可以显著提高受精后的囊胚发育率（P〈0．05）,可以用于牛体外受精胚胎的体外培养。     

培养液中血清或其替代物对牛体外受精卵体外发育的影响

探讨在牛体外受精卵体外培养液中添加血清替代品对体外受精卵发育的影响,确定血清在SOF培养液中合适的添加浓度及添加时期,以筛选优良的牛体外受精卵体外培养液.在SOF液中分别添加10%血清(NBS)、8 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)和1 mg/ml聚乙烯醇(PVA)进行牛体外受精卵的全程培养,添加NBS组的卵裂率(66.3%)显著高于添加BSA组(51.0%)(P＜0.05),极显著高于添加PVA组(47.6%)(P＜0.01);添加NBS组的囊胚发育率(30.9%)显著高于添加PVA组(20.7%)(P＜0.05),极显著高于添加BSA组(13.6%)(P＜0.01).在培养液中添加不同浓度(10%、5%)的NBS及无血清培养液全程培养时,3组之间卵裂率(65.6%、60.0%、58.0%)差异不显著(P＞0.05);10%NBS组囊胚发育率(30.0%)极显著高于5%NBS组(17.6%)和无血清组(6.0%)(P＜0.01).5%NBS组的囊胚发育率极显著地高于无血清组(P＜0.01).在受精卵培养的最初48 h用5%NBS,之后用10%NBS培养液时,卵裂率(58.6%)和囊胚发育率(29.3%)与SOF+10%NBS全程培养组(66.3%、30.9%)差异都不显著(P＞0.05).试验结果表明,SOF培养液中添加PVA、BSA替代血清时卵裂率和囊胚发育率都明显下降,可能SOF培养液中添加血清比添加PVA或BSA更有利于牛体外受精卵的体外发育.体外培养时在SOF培养液中添加一定浓度的血清以及改变血清的添加方式,可提高牛体外受精卵体外发育效果.     

β-巯基乙醇对牛孤雌胚胎发育的影响

【目的】研究β-巯基乙醇(-βME)对牛卵母细胞核成熟和孤雌胚胎发育的影响。【方法】向OMM和SOF中添加0,0.05,0.10和0.15 mmol/L-βME,并在牛卵母细胞激活后,分别于1-细胞期、8~16细胞期、桑葚胚期向SOF中添加0.1 mmol/Lβ-ME,通过比较胚胎体外发育水平确定添加β-ME的最佳时期。【结果】-βME对牛卵母细胞核成熟无显著影响(P>0.05);0.05和0.10 mmol/Lβ-ME均可显著提高牛孤雌胚胎的卵裂率及囊胚发育水平,但以0.10 mmol/L-βME添加组的效果较佳;牛孤雌胚胎发育到1-细胞期和8~16细胞期前,添加0.10 mmol/L的β-ME,均可显著提高囊胚的发育水平(P<0.05),但1-细胞期添加-βME时的囊胚率、囊胚细胞数显著高于8~16细胞期组(P<0.05),故1-细胞期是添加-βME的最佳时机。【结论】-βME对牛卵母细胞核成熟无促进作用,但可提高牛孤雌胚胎的卵裂率并促使囊胚发育,且在8~16细胞期前添加-βME均可提高囊胚发育水平,但以1-细胞添加0.10mmol/Lβ-ME的促进效果最佳。     

外源褪黑素对牛卵母细胞体外成熟的影响

 【目的】探索外源褪黑素（melatonin,MT）处理对牛卵母细胞体外成熟的影响从而优化牛体外胚胎生产体系。【方法】在牛卵母细胞成熟过程中添加不同浓度的MT,观察并统计其体外受精后胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数。应用放射免疫分析法检测血清、卵泡液和成熟培养液内MT与孕酮（P）、雌激素（E2)、促卵泡素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平的变化并检测卵母细胞的活力和活性氧（ROS）的浓度。【结果】存在于牛卵泡液中的MT浓度与血清中的相近,添加10-11 mol•L-1 MT组的P浓度（2.01±0.33）ng•mL-1显著高于对照组（（0.87±0.10）ng•mL-1,P＜0.05）。与对照组（（67.32±7.30）%）相比,10-9 mol•L-1 MT组卵裂率显著提高（（77.81±7.06）%,P＜0.05）,并能提高囊胚率且囊胚细胞数（（29.61±9.55）%,（90.30±28.74）个）,显著高于对照组（（19.64±9.22）%,（75.07±25.98）个,P＜0.05）;同时,10-9 mol•L-1 MT组卵母细胞的活力高于对照组,并能降低卵母细胞内的ROS含量但没有显著差异（P＞0.05）。【结论】牛卵泡液中存在MT,适当浓度的外源MT能促进牛卵母细胞体外成熟。     

不同冻精处理方法和添加咖啡因对牛体外受精的影响

【目的】为了探讨不同冻精处理方法以及添加精子活力激活剂并孵育不同时间获能对体外受精及受精卵发育的影响。【方法】研究对体外受精前的牛冷冻精液分别采用直接离心法、上游法和Percoll法3种方法处理,并对处理后的精液分别用含2.5mM或5.0mM咖啡因的获能液(BO液 10μg/ml肝素钠)在培养箱内预先孵育10min或30min进行获能,不同处理的精子经体外受精后。【结果】结果表明:(1)3种冻精处理方法(直接离心洗涤法、上游法、Percoll法)对精子处理获能,IVF后受精卵的卵裂率(依次为51.58%、52.83%、53.20%)均无显著差异(P>0.05);桑椹胚、囊胚发育率Percoll法处理组(16.66%、10.18%)与上游法处理组(17.85%、16.07%)以及Percoll法处理组与直接离心洗涤法组(8.77%、7.01%)均无统计学差异(P>0.05),同时实验结果还表现出上游法处理组比Percoll处理组的桑囊胚率有所提高,且上游法处理组与洗涤法处理组在桑、囊率上出现了显著差异(P<0.05)。(2)获能液中添加咖啡因组比非添加组(对照组)卵裂率和桑囊胚率有所增加,其中添加5.0mM咖啡因组精子孵育30min的获能效果最佳,卵裂率、桑囊率达到68.59%、28.50%。【结论】以上结果表明上游法处理牛冷冻精液稍优,更有利于以后的受精卵发育;添加咖啡因能提高精子活力,且高浓度的咖啡因维持精子高活力持续时间较长。     

兔类胚胎干细胞的体外培养

为了确立兔类胚胎干细胞(ESCs-like)体外培养方法,研究探讨了兔囊胚形成环境与饲养层细胞对内细胞团(ICM)增殖、ICM原代集落形成以及集落碱性磷酸酶(AKP)阳性率的影响,并在MEF和REF饲养层上进行了兔ESCs-like的体外培养。结果显示,去除透明带桑葚胚在体外具有较高的囊胚发育率和囊胚贴壁率(P<0.05),体外发育囊胚ICM原代集落的AKP阳性率却显著低于体内发育囊胚(P<0.05);与MEF饲养层相比,REF饲养层上ICM原代集落的形成率显著偏低(P>0.05),但原代集落的AKP阳性率却显著高于其余各组(P<0.05);MEF饲养层与REF饲养层均支持兔ESCs-like的传代培养,但F3代后MEF组中ESCs-like的集落形成率显著高于REF组(P<0.05)。     

牛早期胚胎在不同培养液中体外发育比较

以卵丘/颗粒细胞单层作为共培养饲养层，比较了体外受精胚，卵母细胞孤雌激活胚和体细胞核移植胚在几种培养液中体外发育能力，以期筛选较适合体细胞克隆胚胎的体外培养系统。将体外受精卵分别置5种培养液中培养，囊胚发育率分别为20.43％、24.12％、32.10％、20.29％和29.03％，在CM1和CM2中囊胚的孵化率分别为8.64％和20％，结果表明，在添加10％的FBS时培养效果较好。卵母细胞孤雌激活胚在CM2-CM5中囊胚发育率分别是25.09％、29.84％和29.93％。核移植胚胎在CM3和CM5培养液中囊胚发育率为13.04％和9.26％。表明在共培养条件下CM3和CM5可以用于核移植胚胎的体外培养。     

猪体细胞克隆胚胎的体外生产试验

 【目的】通过优化猪体细胞核移植程序,建立获得克隆囊胚的有效方法。【方法】比较不同电激活参数、不同体外培养条件对猪体细胞克隆胚发育能力的影响。【结果】选用1.5 kV?cm-1、80 μs 和1 DC的参数组合,对猪核移植重构胚进行电融合和电激活,可获得较高的卵裂率和最高的囊胚发育率（分别为71.4%和14.3%）,且囊胚发育率显著高于其它组（P＜0.05）;0.4% BSA NCSU 23 培养液培养克隆重构胚72 h,半量换液并未改善克隆胚的发育,但添加10% FBS 可显著提高囊胚发育率（15.1%对10.3%,P＜0.05）和DNA 完整率(56.8%对46.6%,P＜0.05) ;采用猪卵泡颗粒细胞（pGC）共培养体系未能显著提高克隆胚发育率（P＞0.05）,但卵丘细胞（pCC）单层共培养时,囊胚发育率显著高于对照组（16.7%对9.8%,P＜0.05）,培养5 d 的克隆胚凋亡率也显著低于对照组（39.5%对54.2%,P＜0.05）。【结论】采用1.5 kV?cm-1、80 μs 和1 DC 的参数组合对猪克隆重构胚进行电融合和电激活,以0.4% BSA NCSU 23培养液作 pCC 单层共培养72 h,然后换用10% FBS NCSU 23 培养液,可明显提高囊胚发育率。     

牛肌肉抑制素前肽对牛肌卫星细胞增殖的影响

通过PCR扩增目的基因,构建真核表达载体,利用PEI转染牛肌卫星细胞,转染后48与72 h通过CCK-8与流式细胞术检测细胞增殖的变化,通过RT-PCR检测目的基因的表达,通过RT-PCR与Western blot检测下游基因P21,CDK2的表达变化.结果表明,在两个时间点,实验组细胞活力明显升高(P<0.01),G0/G1期细胞所占的比例明显下降(P<0.01),S期细胞所占比例明显上升(P<0.01),MSTN前肽基因有大量表达,P21表达下降,CDK2表达上升.结果揭示,在牛肌卫星细胞中,MSTN前肽通过下调P21,上调CDK2的表达量促进细胞增殖.旨在揭示牛MSTN前肽基因对牛肌卫星细胞(MDSC)增殖的影响,为后续的转基因牛试验提供理论依据.     

表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建

病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点 ,是当今最有发展前景的疫苗研究领域之一。试验将已构建的表达牛流行热病毒 (BEFV)结构糖蛋白 G基因的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )转移载体 pd TK - L ac Z-G,通过脂质体方法转染由牛传染性鼻气管炎病毒 Bartha毒株感染的 MDBK细胞 ,筛选出形成蓝色蚀斑的重组病毒 ,并对其进行蚀斑纯化。通过 PCR方法鉴定该重组病毒证明基因组中含有完整的牛流行热病毒 G蛋白基因 ,实验为开发 BEFV/ IBRV二联基因工程疫苗奠定了基础。     

母牛超数排卵的研究进展

超数排卵技术作为一项实用的繁殖技术 ,在牛的改良和育种中应用广泛。常用的超排程序是 2 0世纪 80年代初成型并推广使用的。现在超排技术基本稳定 ,近 10年国际胚胎移植协会的统计资料表明 ,每头供体牛平均可获得 6枚可用胚。在超排研究中 ,人们最初以减少个体差异和提高受精率为中心 ,逐步转向从激素、程序和饲养管理方面寻找简化实用的改进方法 ,并且对预测个体的超排效果作了一些探索。文章从对供体母牛超排前的预测、超排方案的细化、影响超排效果的因素以及改进超排的思路 4个方面对超排研究进行了论述。     

玻璃化冷冻保存牛卵母细胞技术研究

采用一步法和二步法研究玻璃化冷冻保存的牛生发泡 (GV )期和体外成熟 (IVM)卵母细胞的发育潜力。结果表明 ,冷冻基础液 PBS和 TCM199在玻璃化冷冻中的效果差异不显著 (P>0 .0 5 ) ;冷冻程序和卵母细胞发育阶段对冷冻效果有明显影响 ,二步法冷冻效果显著优于一步法 (P<0 .0 5 ) ,IVM卵母细胞冷冻效果显著优于GV期 (P<0 .0 5 )。     

Myoglobin diffusion in bovine heart muscle

The rotational mobility of myoglobin in situ was determined by proton nuclear magnetic resonance line width measurements of a characteristic myoglobin resonance observed in bovine heart muscle spectra. The protein diffuses intracellularly at nearly half the rate observed in dilute solution. This high mobility allows the oxygenated form of myoglobin to contribute significantly to the overall diffusive flux of oxygen in respiring heart muscle.     

Inserted sequences in bovine satellite DNA's

The nucleotide sequence of the 1413-base-pair repeat unit of bovine 1.711a satellite DNA (density in cesium chloride, 1.711 grams per cubic centimeter) has been determined. The repeat unit contains two segments consisting of variants of a basic 23-base-pair sequence that is closely related to sequences of bovine 1.706 satellite DNA. A third segment of the repeat unit contains an unrelated 611-base-pair sequence that is not internally repetitive. This segment is flanked by inverted repeats of 8 base pairs and, on one side, by a direct repeat of the terminal sequence. A related segment is present in bovine 1.711b satellite DNA and is inserted into sequences derived from the 1.715 satellite. These nucleotide sequences suggest the timing of some of the stages in the evolution of these complex, closely related satellite DNA's and indicate the mechanisms inherent in their divergence from a common ancestor.     

Encephalitogenic activity of bovine basic proteins

Two basic proteins isolated from bovine white matter in connection with a study of the protein-bound phosphoinositides of central nervous system tisstue have been tested for encephalitogenic activity. The biological activity of these proteins, which is equivalent to that of basic encephalitogenic proteins isolated in other laboratories, suggested that they are identical.     

牛前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化

【目的】建立牛前体脂肪细胞的体外分离培养方法,研究牛前体脂肪细胞的生物学特性和分化特征,为研究牛脂肪发育和脂肪沉积的机制提供一种简便有效的细胞模型。【方法】采用Ⅰ型胶原酶消化法自新生牛脂肪组织中获得前体脂肪细胞,对培养的牛前体脂肪细胞进行形态学观察、生长曲线测定、油红O染色及脂肪细胞标志基因LPL、PPAR-r和脂联素表达研究。【结果】80%的牛前体脂肪细胞接种后12h开始贴壁,4d后开始向脂肪细胞转化,10d后绝大部分细胞脂滴融合,细胞脂肪含量增加;分离的牛前体脂肪细胞接种后1~2d生长缓慢,3~8d进入对数生长期,9d后进入平台期,之后细胞数目开始下降。经胰岛素诱导分化过程中,LPL在牛前体脂肪细胞分化的早期开始表达,PPAR-γ在分化的中期开始高度表达,而脂联素在牛前体脂肪细胞分化的前期未检测到,在细胞分化后期高度表达。【结论】用Ⅰ型胶原酶消化法可获得大量的牛前体脂肪细胞。培养的牛前体脂肪细胞成分均一、生长旺盛,经胰岛素诱导后能稳定的向脂肪细胞分化。     

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备

以LF(牛乳铁蛋白)为抗原对BALB/C小鼠进行免疫,利用杂交瘤技术进行融合,制备了3株抗牛LF的杂交瘤细胞,并对其浓度、上清效价、腹水效价、抗体亚类、分泌单克隆抗体稳性定、单克隆抗体分子量等进行鉴定。结果表明,抗体分泌稳定,腹水效价达到106,间接ELISA、Western blot结果显示3株单抗均与FL发生特异性结合;Ig亚类鉴定均为IgG,且轻链均为K链。