抗MATSA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备抗鸡马立克氏病肿瘤相关表面抗原(Marek’s disease tumor-associated surface antigen,MATSA)的单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAb),为马立克氏病的相关研究及研制以MATSA单克隆抗体为载体的抗肿瘤药物提供材料。【方法】用纯化的MATSA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,并对其染色体进行分析。将阳性杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠,制备McAb腹水,采用硫酸铵盐析法粗提McAb,并鉴定其所属亚类。【结果】获得了3株能稳定分泌MATSA McAb的杂交瘤细胞株B3、H6和D6,其培养上清液抗体效价为26~27,Balb/c小鼠接种细胞制得的腹水效价为210~211。染色体分析结果显示,3株杂交瘤细胞染色体数目均为52±2对。3株杂交瘤细胞株所分泌的McAb均为IgG 2b亚类,可与MSB1细胞反应。【结论】获得了MATSA的McAb。     

抗犬瘟热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

[目的]筛选出稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。[方法]用纯化的犬瘟热病毒(CDV)抗原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和有限稀释法克隆杂交瘤细胞。研究了杂交瘤细胞的稳定性和染色体数,测定了单克隆抗体的效价并鉴定其特异性和亚型。[结果]经反复筛选和亚克隆后,共获得3株能稳定分泌抗CDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。3株单抗对CDV均有较高的特异性,与犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒均不反应。3株杂交瘤细胞的腹水效价为1∶(8 000~128 000),细胞培养上清效价为1∶(256~512),染色体数为80~100。3株单克隆抗体重链均属于IgG1,轻链均属于κ链。[结论]该研究为研制CDV快速检测试剂盒奠定了基础。     

水稻细菌性条斑病病原菌(Xanthomonas campestris pv.oryzicola)单克隆抗体的研究

应用淋巴细胞杂交瘤技术,融合经水稻细菌性条斑病病原菌(Xanthomonas campestris pv.oryzicola)免疫的BALB/C小鼠脾细胞和Sp2/O骨髓瘤细胞,经细条病菌典型菌株R17,R25和GX-1单独及三者混合包被进行ELISA检测筛选,建立了能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株18G 9,19D8,21F2,21G3,25E6和26F9细胞株。体外连续传代培养三个月,液氮冻存四个月后复苏培养,分泌抗体稳定。六株杂交瘤细胞的腹水单克隆抗体ELISA效价在1:2000左右。各株细胞的培养上清液ELISA效价为1:8左右。18G9,19D8和25E6细胞株所分泌的抗体为小鼠IgM类,21F2和21G3分泌的抗体为小鼠IgG_3亚类,26F9分泌的抗体为小鼠IgG_(2b)亚类。根据与植物病原细菌4个属6个种的20个不同菌株的特异性反应,将六株单克隆抗体分为A,B,C三组,20个菌株分为3个血清型和1个菌株群。     

溴苯腈单克隆抗体的制备纯化与性能考察

以人工合成溴苯腈免疫原免疫BALB/CF1小鼠,采用杂交瘤技术制备了3株能稳定分泌抗溴苯腈单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用培养扩增后的各建株细胞诱导小鼠生长腹水,腹水效价达10-6～10-7。琼脂双扩试验表明,各单抗蛋白均为IgG,抗体蛋白10B6为IgG1亚类蛋白,3D6和8H2均为IgG2a型亚类蛋白。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体腹水,对纯化的单抗进一步做交叉反应试验,与其他苯腈类农药交叉反应率低于10%,结果表明该单抗有较好的特异性,可用于对溴苯腈的酶联免疫检测,线性检测范围为10～1000μg·kg-1,溴苯腈检测限为10μg·kg-1。     

H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体制备及鉴定

[目的]制备H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)单克隆抗体,为检测诊断AIV提供技术支持.[方法]以灭活H9亚型AIV广西分离株为免疫原,免疫6~8周BALB/c雌性小鼠,然后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经血凝抑制试验(HI)及间接免疫荧光试验(IFA)筛选H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞.[结果]经过4次亚克隆,获得3株稳定的H9单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为8A4、1B11和7F1细胞株,其细胞株培养上清液HI效价为27~210,腹水HI效价为216~219;单克隆抗体亚类鉴定结果表明,3株H9单克隆抗体均属于IgG1亚类,其轻链均为K链.3株H9单克隆抗体只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而与其他HA亚型AIV及新城疫病毒(NDV)、减蛋综合症病毒(EDS)、传染性支气管炎病毒(IBV)无交叉反应.3株H9单克隆抗体细胞株的抗体分泌能力稳定性良好.[结论]用灭活H9亚型AIV为免疫原能成功制备针对H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体,且具有良好的亚型广谱性和特异性.     

产单核细胞李斯特菌溶血素O单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备抗产单核细胞李斯特菌溶血素O(LLO)的特异性单克隆抗体。【方法】用LLO重折叠的原核表达产物LLO-his免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞,与骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,经间接ELISA法筛选、多克隆及单克隆分离出阳性细胞株后,再用体内诱生腹水法大量制备单克隆抗体。用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,间接ELISA法测定其效价及相对亲和常数;用HBT单克隆抗体亚类鉴定试剂盒鉴定抗体亚型;常规方法制备染色体,观察细胞株染色体数目及标志染色体;Western blot检测抗体的特异性。【结果】获得了2株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为3F5-G3和2B4-C8,其腹水效价分别为1∶(1×105)和1∶(1×107);染色体分别为97±5和93±8条,且观察到标志染色体;相对亲和常数分别为0.49和0.26μg/mL;抗体亚类均为IgG1,轻链均为κ链。特异性鉴定结果表明,2种单克隆抗体均可与LLO蛋白发生特异性反应,而与载体蛋白不发生反应。【结论】获得了抗LLO的特异性单克隆抗体。     

抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗H5N1型禽流感病毒单克隆抗体并对其进行鉴定.采用纯化抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌抗AIV-H5N1的单克隆抗体细胞株,将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对腹水抗体进行纯化,测定抗体亚类,并对其抗原结合位点进行分析.共获得了5株单克隆抗体杂交瘤细胞株,均为抗AIV-H5N1的特异性单克隆抗体,而且与H9N1型禽流感病毒,H13型禽流感病毒,鸡新城疫病毒,产蛋下降综合征病毒,鸡传染性支气管炎病毒均无交叉反应.     

抗鸭IL-2单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的重组鸭IL-2蛋白免疫BALB/c 小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,阳性孔经三次有限稀释法克隆,成功获得5株能稳定传代并分泌抗鸭IL-2单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞,分别命名为:1H4、2B3、4G12、5F6、5H6,其中一株对鸡IL-2具有交叉反应性.各单克隆抗体腹水间接ELISA效价在1∶32000～1∶512000之间,抗体类型除mAb 5H6为IgG2a亚类外,其余4株mAb均为IgG1亚类,5株mAb的轻链都为κ链.经Western-blot分析表明,所获得的5株抗鸭IL-2单克隆抗体与鸭IL-2具有反应性,推测它们是针对序列决定簇的.     

醋酸甲羟孕酮(MPA)人工抗原的合成与单克隆抗体的制备

为研制检测醋酸甲羟孕酮（MPA）的免疫学检测技术进行MPA单克隆抗体的制备与鉴定,研究分别采用碳二亚胺法、混合酸酐法将MPA偶联到牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清白蛋白（OVA）上制备免疫原（MPA—BSA）与包被原聊PA—OVA）,通过BALB／c小鼠免疫、细胞融合、间接ELISA和阻断ELISA筛选、有限稀释法克隆亚克隆获得分泌MPA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过ELISA方法对其抗体效价、特异性、敏感性、亚类及稳定性进行鉴定。结果表明：成功合成2种人工抗原,MPA与BSA、OVA的偶联比分别为8：1、12：1;获得1株稳定分泌MPA单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株2G4H9,McAb腹水的间接ELISA效价为1：8×10^4,IgG1亚类,K型轻链,腹水抗体IC50为5．0ng·mL^-1,与甲地孕酮、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和己烯雌酚交叉反应率为12．5％、〈0．01％、〈0．01％和〈0．01％。作者认为：MPA单克隆抗体特异性和敏感性良好,杂交瘤细胞株性能稳定,为进一步研究MPA相关免疫学分析技术奠定了基础。     

新城疫病毒F_(48)E_9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定

制备新城疫病毒(NDV)NP蛋白单抗,以期为NDV抗原表位研究及检测方法建立方面奠定基础。利用NDV F48E9株pET32a-NP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,间接ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗NP重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G3、4B12。经间接ELISA测定,腹水抗体效价分别为1 2.56×105、1 5.12×105。亚类鉴定结果表明这两株单抗均为IgG1。Western blot分析结果显示,1G3、4B12均能特异性识别重组NP蛋白。与NDV感染细胞经间接免疫荧光试验检测均呈黄绿色荧光。经相加ELISA测定表明两株单抗识别的抗原表位不同。     

牛乳铁蛋白直接竞争ELISA检测法的建立

[目的]建立一种检测牛乳铁蛋白(LF)含量的竞争ELISA检测方法。[方法]制备鼠抗牛LF单克隆抗体,采用直接竞争ELISA测定酶标记物效价,建立牛LF的直接竞争ELISA检测方法。[结果]纯化后,制备的鼠抗牛LF单抗效价达1∶1 280 000,且鉴定为IgG1。该单抗对牛乳铁蛋白具有很强的特异性。制备酶标单抗的效价为1∶640 000。抗原包被物和酶标单抗的最适工作浓度分别为1.0μg/ml和1∶40 000。抗原用碳酸盐缓冲液(pH值为9.6)包被先在4℃过夜、再37℃放置2 h的效果最好。采用2%牛血清白蛋白作为封闭剂的效果最好。在31.25~1 000 ng/ml浓度范围内,牛乳铁蛋白的logit(B/B0)与牛乳铁蛋白浓度的对数值呈显著的线性关系,其回归方程为y=-1.899 1x+5.043 3(R2=0.987 3)。[结论]该研究为研制用于奶牛乳腺炎诊断的牛LF检测试剂盒奠定基础。     

Preparation and Identification of Specific Monoclonal Antibody against Porcine Circovirus Type 2

以人工合成 PCV2 Cap蛋白表位的串联多肽作为抗原免疫 BALB/c小鼠,利用淋巴细胞瘤杂交技术获得了1株稳定分泌抗PCV2-rCap 蛋白的杂交瘤细胞株,命名为670#。该株杂交瘤细胞诱导同品系小鼠产生的腹水抗体效价为l∶100000。 Western blot结果显示,该株单抗可与表达原核 PCV2 PET32a-ORF2重组蛋白、真核表达 ORF1-ORF2串联蛋白及 PCV2全病毒细胞培养物反应;间接 ELISA证明该单核可与 ORF1-ORF2串联蛋白结合;IFA结果表明,该单抗可与天然PCV2病毒结合。该单抗的制备为 PCV2抗原表位分析及分子诊断提供了技术手段。     

呋喃它酮代谢物AMOZ单克隆抗体的制备与免疫学特性鉴定

用碳二亚胺(DCC)一步法将对醛基苯甲酸衍生物CPAMOZ偶联于牛血清白蛋白、卵清蛋白上,合成免疫原CNPAMOZ-BSA、包被原CNPAMOZ-OVA。用紫外线扫描、SDS-PAGE进行人工抗原合成的鉴定;免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术建立分泌NPAMOZ mAb的细胞株;对NPAMOZ mAb的效价、敏感性和特异性进行鉴定。结果表明,CPAMOZ-BSA人工抗原分子结合比为15∶1;筛选出分泌NPAMOZ mAb的敏感特异的杂交瘤细胞1株2D11-B4,间接ELISA测定细胞培养上清,效价达到1∶(6.4×102),腹水效价为1∶(1.2×106),对NPAMOZ IC50为7.58μg/L,与其他抗生素交叉反应率低。本试验获得了抗NPAMOZ高价、敏感、特异的mAb,可用于呋喃它酮代谢物AMOZ的残留检测。     

基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度 玉米赤霉醇单克隆抗体

【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇（zearalanol,ZAL）单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮（zearalanone, ZAN）制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺（EDC）法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50 μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC₅₀)为577 pg?mL ^-1,亲和力常数Ka=6.21×10 ⁷L?mol ^-1,与结构类似物β-玉米赤霉醇（β-zearalanol, β-ZAL）、α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol, α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalenol, β-ZEL）、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均<0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的研制

将含有牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV1)囊膜糖蛋白E2编码基因的真核表达质粒pEC143免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组E2蛋白纯化产物为检测抗原,经间接ELISA法筛选和3次有限稀释法克隆,得到1株能稳定分泌抗BVDV1和BVDV2单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该3D8株单抗能识别BVDV1标准毒株(NADL、OregonC24V)、BVDV2标准毒株(890、104)、2株BVDV1分离株和3株BVDV2分离株,而不能识别牛轮状病毒、牛疱疹病毒1型,显示出良好的特异性.阳性杂交瘤细胞的上清液、腹水ELISA抗体效价分别为2~9和10×2~7,为IgM亚类.其单克隆抗体杂交瘤细胞株的获得,为建立单抗介导的检测BVDV1和BVDV2抗原和抗体的血清学方法和实现标准化诊断奠定基础.     

谷胱甘肽转移酶标签蛋白单克隆抗体的制备

以纯化的谷胱甘肽转移酶标签蛋白(GST)免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用纯化的GST筛选,最终获得一株抗GST的杂交瘤细胞系(命名为1D10),染色体平均记数为90对,间接ELISA检测1D10细胞培养上清的效价为1:4 000。腹水效价为1:5×107,该单抗可以特异识别GST蛋白和带有GST标签(GST-tagged)的融合蛋白。     

铜完全抗原的合成·鉴定及单克隆抗体的制备

[目的]获得抗Cu2＋的单克隆抗体。[方法]以异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）为双功能螯合剂,使Cu2＋分别与载体蛋白牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶联,获得免疫原（Cu-ITCBE-BSA）和检测原（Cu-ITCBE-OVA）。用非变性聚丙烯凝胶电泳鉴定偶联结果。免疫Balb/C小鼠,通过细胞融合,获得能稳定分泌抗Cu2＋的杂交瘤细胞株,并通过亲和层析法纯化腹水获得抗Cu2＋的单克隆抗体。[结果]获得了1株能稳定分泌抗Cu2＋的单克隆抗体的细胞株（4A6）,所分泌的抗体亚类为IgG1,细胞培养上清效价可达1∶1.0×103,腹水效价可达1∶6.4×105。以该细胞株接种Balb/C小鼠腹腔,获得抗Cu2＋的腹水型单抗;该腹水经过亲和层析法纯化后,纯度可达95%。[结论]获得了抗Cu2＋的单克隆抗体,为环境水样中Cu2＋的免疫学检测奠定基础。     

鸭肝炎病毒单克隆抗体的研究

[目的]研制鸭肝炎病毒的单克隆抗体。[方法]将DHV-W株的鸭胚尿囊液经冻融、氯仿处理和超速离心纯化后,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,探讨DHV特异性强、敏感性高、简便快速的DHV抗原诊断方法。[结果]经间接ELISA筛选获得1株能稳定分泌DHV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5G8。特性鉴定结果表明该株单抗ELISA效价较高且特异性好,中和特性稍差。杂交瘤细胞冻存6个月和12个月后复苏能稳定分泌特异性抗体。[结论]HDV的McAb成功制备为DHV的快速诊断、筛选特定基因探针等技术奠定了基础。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br#

 【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng&#8226;mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng&#8226;mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。