基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度玉米赤霉醇单克隆抗体

【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇(zearalanol,ZAL)单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN)制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺(EDC)法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC50)为577 pg·mL~(-1),亲和力常数Ka=6.21×10~7 L·mol~(-1),与结构类似物β-玉米赤霉醇(β-zearalanol,β-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZEL)、β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZEL)、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。     

玉米赤霉醇完全抗原的制备及质量鉴定

旨在合成玉米赤霉醇(ZER)人工抗原,并用其免疫小鼠以获得含高滴度ZER多克隆抗体的小鼠血清,为ZER单克隆抗体的制备奠定基础。改造ZER第16位上的羟基,合成半抗原ZER-16-羧丙基丁醚,然后分别采用混合酸酐法和碳二亚胺(EDC)法将改造后的半抗原与载体蛋白BSA或OVA偶联,制备免疫原ZER-BSA和包被原ZER-OVA,并采用凝胶电泳、动物免疫对人工抗原进行质量鉴定,间接ELISA测定抗血清效价,间接竞争(阻断)ELISA测定抗血清的敏感性和特异性。结果表明,用制备的免疫原免疫小鼠血清效价均已达到1∶104以上。6号鼠的血清敏感性最高,对ZER的半数抑制质量浓度(IC50)达15.77ng/mL,获得的血清除与α-玉米赤霉醇特异性反应外,与其结构类似物β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮分别有12.5%、100%、12.5%、25%、100%的交叉反应,与其他霉菌毒素交叉反应性均小于0.5%。表明试验成功获得ZER人工抗原,通过动物免疫制备敏感性好、特异性强的ZER多克隆抗体,为ZER单克隆抗体的制备及其免疫学检测方法的建立奠定基础。     

东北地区水稻、小麦和玉米镰孢菌鉴定与ZEN毒素检测

在黑龙江、吉林和辽宁三省的13个市县,水稻、小麦和玉米的主要产区共分离到214株镰孢菌株,其中分离频率最高的是禾谷镰孢菌(58.1%)。镰孢菌株产生玉米赤霉烯酮(ZEN),具有较强生物毒性,对人畜有很强的毒害作用,因此检测作物中玉米赤霉烯酮含量是十分必要的。单克隆抗体进行特异性分析结果显示,抗-ZEN单克隆抗体与ZEN、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉烯醇结合率分别为100%、188.7%、43.9%和25.6%,而与脱氧雪腐镰刀菌烯醇和黄曲霉毒素的结合率则均小于1.0%,由此证明试验制备的单克隆抗体具有较高特异性。以该单抗为依据建立的ELISA检测法,检测限为0.4 ng/m L,检测区间为0.4~25.00 ng/m L,曲线回归方程y=-0.7673x+3.1318,与相似毒素的交叉反应率均小于1.0%,回收率在79%~112%之间。用ELISA产毒能范围在0.27~1.61μg/L,其中有6株禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)菌株具有产毒能力。研究结果说明建立的间接竞争ELISA方法可以用于检测玉米赤霉烯酮。     

快速检测生鲜乳中玉米赤霉醇试纸条的研制及其应用

[目的]采用免疫胶体金技术,建立了一种快速检测玉米赤霉醇的试纸条方法。[方法]利用有机合成方法,研制了一种玉米赤霉醇半抗原,将其载体蛋白偶联得到免疫抗原,并通过人工免疫的方法获得单克隆抗体。通过酶联免疫法对制备的单克隆抗体的性能进行了验证。玉米赤霉醇层析试纸条是利用单克隆抗体标记胶体金,其原理是玉米赤霉醇抗原和羊抗鼠Ig G分别喷到自制的膜(硝酸纤维)上,然后将样品垫、吸水垫分别放置在PVC板上,再制成试纸条。[结果]试纸条检测限可达0.5~1.0μg/kg,具有速度快、简单等优点。此外,该试纸条与大部分的玉米赤霉醇没有明显的交叉反应。[结论]利用该试纸条可实现对生鲜乳中玉米赤霉醇添加试验的准确判定。该试纸条有望实现对生鲜乳中玉米赤霉醇残留的快速筛查。     

一株苯酚降解菌的筛选、鉴定及相关降解特性

【目的】筛选苯酚化合物相关降解微生物,确定其相关功能特性,为进一步揭示相关降解机制以及开发利用该菌株提供科学依据和基础。【方法】以苯酚为筛选压力对盐爪爪根际微生物进行分离筛选,采用16S rDNA序列测序确定相关降解菌的生物学地位,并对其抗逆特性和功能特性进行分析,开展其对苯酚和玉米赤霉烯酮降解的研究。【结果】获得了一株编号YZZ-9的菌株,经鉴定该菌为沼泽考克氏菌(Kocuria palustris),其能够在10%的NaCl,3.5 g/L的苯酚下生长良好,且能利用多种苯类化合物为单一碳源生长。当培养基中苯酚浓度低于1.0 g/L时,苯酚可在120 h内完全降解;当苯酚浓度达到1.5 g/L,培养基中的苯酚降解几乎完全被抑制。同时,菌株可明显降解玉米赤霉烯酮,当菌株培养144 h时,培养基中玉米赤霉烯酮降解率可达68.9%。【结论】菌株YZZ-9具有良好的苯酚和玉米赤霉烯酮降解能力。     

竞争间接ELISA检测饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮

应用本实验室研制的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇和抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体建立的竞争间接ELISA方法对江西省部分猪场的45份猪全价饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮的含量进行了检测,结果67%样品的玉米赤霉烯酮含量大于100 ng/g,4份样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的含量超过国家限量标准100 ng/g。     

应用生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法检测谷物中的玉米赤霉烯酮

基于生物素-链霉亲和素的酶联免疫吸附法(ELISA),建立了玉米赤霉烯酮(ZEN)的ZEN-ELISA检测方法。该方法的检测灵敏度为0.8 ng/ml,批内、批间变异系数分别为5.1%和8.6%,平均加样回收率为91.2%;抗ZEN单克隆抗体与玉米赤霉醇的交叉反应度为12.3%,而其与赭曲霉素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉素B1无交叉反应;相关试剂在4℃存180 d后各检测参数基本无变化;该方法与商品ELISA试剂盒对同一样品ZEN测定结果的相关系数为0.943 2。说明该方法的特异性和稳定性较好,测定结果准确,可用于ZEN的大量筛查。     

农产品中玉米赤霉醇ELISA检测试剂盒的研制与应用

[目的]建立快速、有效检测农产品中玉米赤霉醇(ZER)残留量的方法。[方法]试验以人工合成的ZER为包被原,ZER为竞争半抗原,两者与一定量的抗玉米赤霉醇单克隆抗体反应,应用间接竞争ELISA法建立玉米赤霉醇单克隆抗体快速检测农产品中ZER含量的半定量检测,同时对该ELISA试剂盒进行了调试。[结果]试验建立检测ZER的ELISA方法,其最适包被浓度为1∶5 000,抗体最适工作浓度为1∶2 500,酶标二抗的最适工作浓度为1∶5 000。试剂盒检测限为0.5 ng/ml,添加回收率在70.0%~116.0%,变异系数小于20%,在2~8℃条件下可保存90 d。[结论]该试验建立的方法可应用于玉米、小麦、高粱等中的玉米赤霉醇的检测,应用前景广阔。     

抗番鸭呼肠孤病毒(MDRV)单克隆抗体的制备及应用

【目的】制备抗番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的单克隆抗体,建立番鸭呼肠孤病毒病的间接免疫荧光（IFA）快速诊断方法。【方法】制备MDRV抗原,用之免疫Babl/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用IFA和ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备单克隆抗体,检测其生物学特性,应用制备的单克隆抗体建立MDRV IFA快速诊断方法。【结果】筛选到237-11,45-12和3-H3 3株特异性好并能稳定分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中45-12株单抗为IgM亚型,237-11和3-H3株单抗为IgG3亚型。45-12和3-H3 2株单抗具有ELISA特性,效价分别为10-4和10-5;237-11株单抗具有IFA特性,效价达10³。特异性测定结果显示,3株单抗仅与MDRV反应,而与正常细胞培养物（MDEF）、番鸭细小病毒（MPV）、鹅细小病毒(GPV)、禽呼肠孤病毒(ARV) 、鸭副黏病毒（PMV）和鸭肝炎病毒（DHV）均无交叉反应。应用抗MDRV单抗建立的IFA方法与病毒分离法（VI）的符合率为91%。【结论】筛选到2株具有ELISA特性、1株具有IFA特性且能分泌抗MDRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,建立了MDRV IFA快速诊断方法,为番鸭呼肠孤病毒病的快速诊断奠定了基础。     

伏马毒素B1单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法的建立

采用戊二醛法将半抗原伏马毒素B1分别与载体蛋白钥孔血蓝蛋白（KLH）和蛋白卵清白蛋白（OVA）偶联成为完全抗原KLH-FB1和OVA-FB1。OVA-FB1作为包被抗原建立ELISA方法;KLH-FB1作为免疫原免疫8周龄Balb/c小鼠,应用杂交瘤细胞融合技术制备单克隆抗体。经三次亚克隆后,筛选出两株（6H3,6H11）能特异、稳定分泌抗FB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。选择其中一株杂交瘤细胞通过体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体,经检测表明单克隆抗体的亚型为IgG1,轻链为κ型。采用间接ELISA测得腹水纯化后效价达l∶16 000,抗体对伏马毒素的半数阻断浓度（IC50）为8.26 ng/mL,对玉米赤霉烯酮、黄曲霉素B1等结构类似物几乎不存在交叉反应,与其他结构的氯丙嗪、链霉素等无交叉反应。利用获得的抗FB1单克隆抗体,建立了间接竞争ELISA检测方法,检测灵敏度为0.44 ng/mL,检测线性范围为0.93~73.06 ng/mL,加标回收率在线性范围内达到回收率可达78.4%~102%。     

抗链霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】筛选抗链霉素特异性单克隆抗体,并初步建立其竞争ELISA快速检测方法。【方法】用EDC方法将链霉素(SM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原SM-BSA及SM-OVA,SM-OVA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后,SM-BSA包被酶标板,ELISA筛选阳性克隆,并经有限稀释单克隆化及亚型鉴定,所获阳性克隆注射BALB/c小鼠,制备单抗腹水,并进一步western-blot鉴定其特异性,并对其竞争ELISA检测方法进行优化。【结果】经有限稀释,获单克隆抗体7株,其中链霉素特异性单克隆抗体1株,对其竞争ELISA反应条件进行了优化。【结论】获抗链霉素单克隆抗体1株,并初步建立了其竞争ELLISA方法。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br#

 【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

伏马菌素B1单克隆抗体的制备及鉴定

 【目的】真菌毒素可导致严重的食品安全问题。本试验旨在制备可用于检测伏马菌素B1的特异性单克隆抗体。【方法】制备伏马菌素B1人工抗原,杂交瘤细胞法筛选杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体,并对其特性进行鉴定。【结果】筛选得到杂交瘤细胞株F3,分泌的单克隆抗体亚类为IgG1,轻链类型为κ链;10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单抗蛋白重链分子质量约为50 kD,轻链分子质量约为25 kD;间接酶联免疫吸附法测定杂交瘤细胞F3细胞培养上清和腹水效价分别为1:3 200和1:51 200;亲和力常数为1.60×10-8 mol•L-1;IC50值可达3.589 ng•mL-1;对其它真菌毒素不存在交叉反应;免疫转印法鉴定抗体具有高特异性。【结论】本试验制备FB1单克隆抗体具有较好亲和力和高特异性,具有良好的应用价值。     

纳米酶免疫层析试纸条法检测玉米褪绿斑驳病毒

【目的】建立纳米酶免疫层析试纸条(Nanozyme Immuno-chromatographic Strip Assay, NISA)检测玉米褪绿斑驳病毒方法。【方法】采用双抗夹心法,将纳米酶标记的鼠抗体IgG与McmV结合后,再与硝酸纤维素膜质控线上的鼠抗体结合,二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)滴加显色。【结果】采用研制的NISA和反转录PCR法(RT-PCR)对玉米褪绿斑驳病毒梯度稀释的研磨液进行检测,灵敏度分别为10^-7和10^-5;用其他4种病毒作对照进行特异性实验,无交叉反应;用该试纸条对供试样品进行检测,并以RT-PCR方法及基因测序方法对检测结果进行验证,三者检测结果一致。【结论】该试纸条检测McmV的灵敏度高、特异性强,可用于科研、农业生产单位和口岸机构对McmV的检测。     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

分泌抗春雷霉素单克隆杂交瘤细胞株的建立 及免疫学特性鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的抗春雷霉素单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】采用EDC法将KSM分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫原KSM-BSA和包被原KSM-OVA,经SDS-PAGE鉴定后,免疫Balb/c小鼠,免疫间隔4周,4次免疫后,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗KSM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗KSM的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】SDS-PAGE鉴定结果显示KSM-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠血清效价均达1:104以上,其中3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为73.9ng•mL-1,融合后筛选出两株杂交瘤细胞株1G7和2C8,亚型均为IgG1型,其细胞上清效价分别为1:5.12×103 和1:1.28×103,腹水效价分别为1:5.12×105和1:2.56×105,抗KSM的单克隆抗体对春雷霉素的IC50为8.902ng•mL-1,与其它竞争物的交叉率均小于0.03%。【结论】本试验成功合成了春雷霉素人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为春雷霉素免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

农产品中黄曲霉毒素产毒菌标识性分子大容量反应体系 提高ELISA灵敏度

【目的】 为预防和降低黄曲霉毒素污染,在前期探明黄曲霉毒素产毒菌株鉴别标识性分子PO8蛋白的基础上,欲研究建立高灵敏、大容量反应体系的双抗夹心ELISA检测技术,为污染源头监控提供技术支撑。 【方法】 用干菌丝作标识性分子PO8蛋白的参考物,以高压均质制得的黄曲霉菌裂解液为检测抗原,纯化后的PO8-VHH作包被抗体,产毒菌株多抗作检测抗体,抗原、抗体分别以200 μL/孔加入到96孔酶标板,进行大容量反应体系夹心ELISA法的试验。优化相关理化因素,以阳性孔OD_450nm≥1.0,阳性孔OD_450nm/阴性孔OD_450nm较高为原则,确定最佳试验条件,建立标准曲线。并通过样品添加回收试验、重复性试验、特异性试验,对建立的夹心ELISA方法进行性能评估。 【结果】 通过棋盘格试验确定了最佳包被抗体浓度为3.0 μg?mL ^-1,最佳多抗的工作浓度为2.5 μg?mL ^-1。优化反应条件确定：最佳抗体包被条件为4℃过夜,最佳封闭液为3%的BSA,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,最佳多抗作用条件为37℃反应50 min。在优化后的条件下建立了夹心ELISA方法的标准曲线,对黄曲霉菌检测限可达到0.1 μg?mL ^-1,比前期报道的常规容量反应体系灵敏度提高了约10倍。该方法特异性强,与青霉菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、赭曲霉菌均无交叉反应,且检测非产毒黄曲霉菌株信号值较低,接近于阴性值。重复性试验显示,板间变异系数为1.5%—5.8%,板内变异系数为0.4%—3.2%,均小于7%,说明该方法稳定性好。采用该方法对花生、玉米等农产品进行添加回收试验,平均回收率在81.9%—109.0%。 【结论】 本研究建立的大容量反应体系夹心ELISA方法可快速、高灵敏地检测黄曲霉毒素产毒菌,为从源头上控制黄曲霉毒素污染提供了新的快速、方便的检测技术支撑。     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。     

基于SodC单克隆抗体的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法的建立及应用

【目的】胞内劳森菌（Lawsonia intracellularis,LI）是引起猪增生性肠炎（porcine proliferative enteritis, PPE）的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针对LI的免疫过氧化物酶细胞单层试验（IPMA）抗原检测方法,检验其在临床上的应用性,从而为LI的病原诊断提供一种科学有效的手段。【方法】选取胞内劳森菌弱毒疫苗为研究对象,通过PCR扩增其sodc片段,将其克隆至原核表达载体pGex-6p-1上,成功构建出pGex-6p-1-sodc重组质粒,诱导表达重组蛋白SodC。Western Blot分析重组蛋白的反应原性,一抗使用鼠抗GST标签的抗体。以该重组蛋白为免疫原,免疫4—6周龄BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术、有限稀释法和间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞,并制备腹水。通过间接免疫荧光（IFA）鉴定该单抗的特异性。以该单抗为一抗,摸索并建立了LI IPMA抗原检测方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。用优化后的IPMA方法对来自江苏周边地区猪场回肠组织样品进行检测,评价该方法的临床价值。【结果】纯化后SodC蛋白浓度较高,与鼠抗GST标签的抗体发生特异性结合,表明该蛋白反应原性较好。经3次亚克隆后最终共筛选获得2株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1D6和1F7。单抗亚型鉴定结果显示：1D6亚型为IgA,1F7亚型为IgG3;ELISA检测1D6单抗效价为1﹕1 024 000;1F7单抗效价为1﹕1 024 000;间接免疫荧光（IFA）结果表明2株单抗均与LI菌株发生特异性反应,与猪霍乱沙门氏菌（Salmonella Cholerasuis,S. Cholerasuis）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）等猪常见病原无交叉反应。优化后IPMA反应条件为：一抗稀释倍数为1﹕800,作用45min;二抗稀释倍数为1﹕2 500,作用1h,此时IPMA检测效果最佳。用该方法检测S. Cholerasuis、PEDV、TGEV、伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2（PCV2）均为阴性;最低检测限为10³个/mL,说明该方法特异性强、敏感性高。临床样品检测结果显示146份病料中共检测出92份阳性样品,3个不同猪场的阳性样品检出率分别为65.6%、68.2%和53.7%,总体阳性率为63.0%。普通PCR方法检测出82份阳性样品,两种方法的阳性符合率为94.6%。【结论】成功制备了鼠抗LI SodC蛋白的单克隆抗体,建立了针对LI抗原的IPMA检测方法,并对临床样品进行了检测。该方法具有良好的特异性和敏感性,并具有一定的临床价值,为实验室LI的分离鉴定、在感染细胞中的定位以及流行病学调查和相关检疫提供一种有效的技术手段。