小鼠ES细胞在不同饲养层上培养nanog基因的 表达水平与生长行为

观察小鼠ES-D3细胞在MEF、新生牛睾丸支持细胞(nBTSCs)和新生兔睾丸支持细胞(nRTSCs)饲养层上生长4dnanog基因的表达水平和生长行为。RT-PCR分析显示,MEF饲养层上培养4d的ES-D3nanog基因含量高;nBTSC饲养层上培养nanog基因表达较低;而RTSC饲养层上培养nanog基因表达最低。结果显示:不同饲养层上的ES-D3细胞集落形态和培养4d分化程度有差异。在MEF饲养层上的ES-D3细胞培养4d,集落形态仍然很规则,细胞间紧密,集落表面少见大细胞,AKP染色强阳性。在nBTSC饲养层上的ES-D3细胞,集落界限清晰,AKP染色显示,集落大部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为弱阳性,可见集落表面分散有较多的大细胞。在nRTSC饲养层上的饲养层上的ES-D3,集落隆起不明显,集落界限不清晰,大部分集落形态不太规则,AKP染色显示集落中部分细胞呈阳性,少数的细胞集落为全阴性,集落表面有较少的大细胞,集落周围有伸出的成纤维细胞。     

湖羊精原干细胞体外培养

研究了湖羊精原干细胞(SSCs)体外培养方法,湖羊睾丸曲精细管两步酶消化法制备细胞悬液,Percoll分离后比较SSCs纯化方法、FCS以及GDNF对SSCs体外培养与集落碱性磷酸酶(AKP)染色的影响。结果显示,虽然盘化法纯化的SSCs在集落形成时间与集落数上显著低于差速贴壁法(P<0.05),但是盘化法所得集落的AKP阳性率显著高于差速贴壁法(P<0.05);添加1% FCS的培养基可显著降低集落形成的时间,增加集落的数目与AKP阳性率(P<0.05),但集落形成时间与AKP阳性率在5%与1% FCS之间无显著变化(P>0.05);20 ng/mL GDNF处理组内集落数与AKP阳性率显著高于10 ng/mL GDNF(P<0.05),但集落形成时间与AKP阳性率与30～40 ng/mL GDNF的处理组无显著差别(P>0.05)。     

牛体外受精卵与牛胎儿睾丸支持细胞体外共培养研究

【目的】研究牛胎儿睾丸支持细胞对牛早期胚胎的体外发育是否有促进作用。【方法】从屠宰场采集5~7月龄胎牛睾丸,经原代和传代培养制备牛胎儿睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)饲养层,对比原代和传代胎牛睾丸SCs与牛体外受精卵共培养时受精卵的发育情况;分别以4×104,2×104mL-1两个密度接种传代胎牛睾丸SCs与牛受精卵体外共培养,并以培养液中无牛胎儿睾丸SCs饲养层为对照,研究体外牛胎儿睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)对牛受精卵体外发育的影响。【结果】与牛受精卵体外共培养时,接种密度为2×104mL-1传代胎牛睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率(79.3%)高于原代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组(69.2%),但差异不显著(P>0.05);囊胚发育率(41.3%)极显著地高于原代SCs饲养层共培养组(16.7%)(P<0.01)。接种密度为4×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组的卵裂率大于接种密度为2×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组,但差异不显著;胚胎发育率极显著地低于接种密度为2×104mL-1传代牛胎儿睾丸SCs饲养层共培养组和对照组。【结论】制备的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层,能有效促进牛体外受精卵的体外发育,提高囊胚发育率;接种的传代牛胎儿睾丸SCs饲养层密度过大,将严重影响牛体外受精卵的发育。     

BRL-CM在昆白小鼠胚胎干细胞分离培养中的应用

目的:探讨Buffalo大鼠肝细胞条件培养基(BRL-CM)在昆白小鼠胚胎干细胞(ES)分离培养中的应用。方法:用BRL-CM培养生长在STO(一种小鼠成纤维细胞)饲养层上的昆白小鼠的桑椹胚和囊胚,然后由囊胚内细胞团(ICM)得到ES细胞集落,在有饲养层和无饲养层时用BRL-CM培养分离得到的ES集落。结果:桑椹胚在上述培养条件下能发育成囊胚,然后囊胚在饲养层上长出ICM;用0.1%Trypsin-0.016%EDTA离散ICM,接种到饲养层上培养得到ES集落,ES集落能维持早期传代。结论:在分离培养昆白小鼠的ES细胞时,BRL-CM结合STO饲养层可以用来培养桑椹胚和囊胚,桑椹胚可以发育为囊胚并孵出内细胞团;同时,这种培养条件也能维持昆白小鼠ES细胞的增殖和早期传代。     

无血清培养山羊内细胞团的研究

对32只关中奶山羊进行超排处理,获得胚胎263枚,其中囊胚122枚。采用机械法、酶消化法和免疫外科法分离囊胚83枚,得到内细胞团(ICM)65个。将ICM培养于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上,研究含血清和无血清条件下ICM的增殖规律,并比较添加不同生长因子对ICM增殖的影响。结果表明,无血清培养时,ICM细胞增殖相对较慢,分化减少;添加LIF、bFGF、两种同时添加或均不添加对原代ESC样集落形成率的影响不显著(P>0.05),但添加10 ng/mL bFGF稍微有助于ICM增殖。山羊ICM适宜于无血清培养。     

不同饲养层对兔原始生殖细胞传代培养的影响

为了探讨不同饲养层细胞对兔原始生殖细胞体外培养与传代的影响,从14~18 d的兔胎儿生殖嵴中分离得到原始生殖细胞(PGCs),分别培养在小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、兔胎儿成纤维细胞(REF)饲养层上或与同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞(HEFgr)、兔睾丸支持细胞(RSC)共培养。观察兔类EG集落的生长状态,并检测其碱性磷酸酶活性。结果表明:4种方法均能分离克隆出兔类EG集落,碱性磷酸酶染色均呈阳性,但是采用共培养的模式分离得到的集落明显多于传统的饲养层模式。与RSCs共培养得到的EG集落数最多,保持未分化的时间最长,并传了8代,与HEFgr共培养得到的EG集落数与RSCs相比差异不明显,但最高只传了6代。培养在MEF上的兔类EG也能较好的保持未分化状态,传了4代。培养在REF上的兔类EG集落数目较少,出现分化时间较早,只传了3代。因此可以用与RSCs或HEFgr共培养的方法传代培养兔PGCs。     

由猪囊胚内细胞团分离胚胎干细胞的研究

以 PMEF为饲养层培养猪 7～ 9日龄囊胚分离 ES细胞 ,ICM初次传代时间为 4～ 7d,ES细胞传代时间为 4～ 5 d,ES细胞传至 1～ 5代的胚胎数分别为 1 2 (1 8.8% ) ,8(1 2 .5 % ) ,5 (7.8% ) ,3(4 .7% ) ,2 (3.1 % ) ,并进行体外分化和 AKP染色鉴定。对影响猪 ES细胞分离与克隆的因素进行比较 ,结果表明 :(1 ) 9和 1 4日龄小鼠胎儿 PMEF饲养层培养 9日龄猪囊胚 ,贴壁率 (83.3% ,88,9% ) ,ICM形成率 (75 .0 % ,77.8% )和 1代 ES细胞克隆率(2 5 .0 % ,2 2 .2 % )无显著性差异 (P>0 .0 5 )。 (2 ) 7,8和 9日龄胚胎随胚龄增加 ,胚胎贴壁率 (5 .9% ,5 7.1 % ,87,9% )和 ICM形成率 (0 .0 % ,2 8.6 % ,81 .8% )升高 ,差异显著 (P<0 .0 1 )。(3) 9日龄囊胚直径 0 .8～ 1 .2 m m培养36～ 4 8h贴壁 ,贴壁率 1 0 0 % ,ICM形成率 1 0 0 % ;直径 >1 .2 mm囊胚贴壁时间为 4 8～ 72 h,贴壁率 5 7.1 % ,ICM形成率 5 7.1 % ,差异显著 (P<0 .0 5 )。去除直径 >1 .2 m m囊胚部分滋养层细胞培养 36～ 4 8h,贴壁率 91 .7% ,ICM形成率 83.3% ;(4 )添加外源 L IF没有提高贴壁率 (86 .4 % ,90 .9% ;P>0 .0 5 )和 ICM形成率 (81 .8% ,81 .8% ;P>0 .0 5 )     

巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对小鼠胚胎体外发育的影响

以小鼠自然受精与体外受精胚胎为模型,探索鼠源巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在小鼠胚胎早期发育过程中的生理功能。分别使用添加不同剂量(对照组:0 ng.mL-1;试验组:0.5、2和10 ng.mL-1)GM-CSF的化学限定培养基连续培养小鼠自然受精、体外受精原核期与2细胞期胚胎,检测其胚胎着床前发育效率(卵裂率、囊胚率)及囊胚的质量(囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率、凋亡指数)。结果发现,对自然受精胚胎而言,原核时期添加不同剂量的GM-CSF,其卵裂率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均差异不显著,但10 ng.mL-1试验组的囊胚率显著低于对照组(61.6±5.1)%(P0.05);2细胞时期添加不同剂量的GM-CSF,其囊胚率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均差异不显著,但试验组中的囊胚凋亡指数均显著低于对照组(P0.05)),并且试验组中2 ng.mL-1的囊胚凋亡指数最低,显著低于0.5 ng.mL-1(P0.05),其他试验组之间的囊胚凋亡指数没有统计学上的差异性。对体外受精胚胎来说,原核时期添加GM-CSF,其卵裂率、囊胚率、囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率在各组之间均无显著性差异;在2细胞时期,10 ng.mL-1组的囊胚率显著低于对照组及其他2个试验组(P0.05),但各组之间的囊胚总细胞数、ICM/总细胞数的比率均无显著性差异。本研究结果表明,在化学限定培养基中添加一定剂量的GM-CSF有利于改善小鼠自然受精与体外受精囊胚的质量,但剂量过高可能不利于小鼠受精胚胎的早期发育。     

牛与小鼠胚胎在分化抑制培养系统中的行为比较

在自制培养基中 ,以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲养层 ,观察比较了牛与小鼠胚胎在体外分化抑制培养体系中的生长行为。结果表明 ,牛囊胚一般培养 36～ 6 0 h后孵化脱带 ,96～ 12 0 h后贴壁 ,12 0～ 144 h为ICM传代的最佳时刻。小鼠囊胚一般培养 12～ 2 4h孵化脱带 ,2 4～ 48h贴壁 ,72～ 96 h为传代的最佳时刻。牛胚胎贴附于饲养层上生长 ,极易从饲养层上剥离 ;小鼠胚胎镶嵌在饲养层中 ,滋养层细胞与饲养层细胞间连接紧密。牛ICM色深发黑 ,集落隆起程度较低 ;小鼠 ICM呈暗黄色 ,有呈柱状增殖的趋势。牛滋养层呈网状 ,小鼠滋养层为较致密的单层薄膜     

牛与小鼠胚胎在分化抑制培养系统中的行为比较

在自制培养基中，以原代小鼠胎儿成纤维细胞为饲层，观察比较了牛与小鼠胚胎在体外分化抑制培养体系中的生长行为，结果表明，牛囊胚一般培养36－60h后孵化脱带，96－120h后贴壁，120－144h为ICM传代的最佳时刻，小鼠囊胚 般培养12－24h孵化脱带，24－48h贴壁，72－96h为传的最佳时刻牛胚胎贴附于饲养层上生长，极易从饲养层上剥离，小鼠胚胎镶嵌在饲养层中，滋养层细胞与饲养层细胞间连接紧密，牛ICM色深发黑，集落隆起程度较低，小鼠ICM呈暗黄色，有呈柱状增殖的趋势，牛滋养层呈网状，小鼠滋养层为较致密的单层薄膜。     

Research on Isolation and Clone of Embryonic Stem Cell-Like in Bovine

Bovine embryonic stem cell would be invaluable for researching the aspect of animal cloning, production transgenic animal and discussion of gene function in vitro. With the object of establishing an effective culture system for isolation and clone of bovine pluripotent stem cell, we cultured bovine embryos and mouse embryos including morula blastula and hatached blastula and obtained animal ICM on Primary marine embryonic fibroblast (Primary murine embryonic fibroblast, PMEF) feeder layer with tissue medium(DMEM supplemented with 15ml/100ml NBS ,0.1μmol/L Na2SeO3, 0. 1mmol/L β-mercaptoethanol, 1 000ng/ml LIF,10 ng/ml IGF, 1mmol/L necessary amino acid and 1mmol/L L-glutamine), then, we obtained mouse ICM and bovine ICM. Moreover, we isolated and cloned the 6 passage bovine ES like cells(12 cell lines) and 9 passage marine ES like cells (52 cell lines) deriving from bovine ICM and murine ICM respectively on the feeder layer of PMEF by disaggregating ICM and ES cell clones of bovine and murine into smaller clumps through digesting with 0. 125g/100ml trypsin and 0.02g/100ml EDTA and scattering with a glass needle. The pluripotency of both murine and bovine ES like cells was identified with morphological character, histochemistry identification, karyotype analysis and differentiation of ES cells in vitro or in vivo. This result showed that bovine embryonic stem cell and murine embryonic stem cell had developmental pluripotency.     

小鼠胚胎干细胞培养体系的建立

通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素，建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系，并建成小鼠ＥＳ细胞系     

牛和小鼠胎儿成纤维细胞混合制成的饲养层对牛胚胎干细胞的体外培养

【目的】建立适合的牛胚胎干细胞培养环境,保持其未分化状态,保证细胞的全能性。【方法】分别培养小鼠胎儿成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）和牛胎儿成纤维细胞（bovine embryonic fibroblast,BEF）,用丝裂霉素C处理两种成纤维细胞分别计数后按1﹕0、1﹕1、2﹕1、1﹕2和0﹕1的比例制成混合饲养层,观察牛胚胎干细胞的生长状态,并对生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞进行碱性磷酸酶,OCT4和SSEA-1免疫组化检测,OCT4、SOX2、NANOG mRNA 表达RT-PCR检测、体外分化形成拟胚体等试验。【结果】①生长在混合饲养层上的牛胚胎干细胞比单独生长在小鼠或牛胎儿成纤维细胞饲养层的结构致密、与滋养层界限明显;②小鼠胎儿成纤维细胞和牛胎儿成纤维细胞在1﹕1比例混合下牛胚胎干细胞克隆结构致密、显著堆积且边缘轮廓清晰优于其它比例组合;③获得的牛胚胎干细胞AKP染色及OCT4、SSEA-1抗原表达均成阳性,分别在体外分化培养形成了拟胚体。【结论】小鼠和牛胎儿成纤维细胞在以1﹕1的比例混合下制成的饲养层可更好地支持牛胚胎干细胞的体外培养,获得的克隆形态最好。     

Research on Growth Behavior of Embryos for Bovine and Murine on Primary Murine Embryos Fibroblast Cell Feeder Layer

The difference in growth behavior between bovine embryos and murine embryos was studied on PMEF(primary murine embryos fibroblast)feeder layer. The results showed as follows: With embryos having attached, bovine embryonic trophoblast formed a transparent membranous structure covering on inner cell mass (ICM), however, murine embryonic trophoblast formed disc structure. Bovine embryos formed four kinds of ICM colonies with different morphology including the mass-like, the net-like, the stream-like and the mixture-like colonies. Compared with Murine ICM, the bovine ICM grew more fast. So, the bovine ICM was passaged at first after a culture of approximately 5 - 6 days in vitro, but murine ICM was passaged at first after an attachment of 3 - 4 days on PMEF feeder layer. The mixture colonies of bovine ICM differentiated very early, while the others differentiated very late. Most ICM-like mass of Bovine grew in a defined spot, but bovine ICMs like stream and ICMs like net proliferated fast and dispersed quickly. We found that the single blastomeres derived from late bovine morula and late murine morula formed sub-blastophere; moreover, the bovine ICM cell would differentiate rapidly if the trophoblast was removed.     

大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的效果

采用大鼠心肌条件培养基对昆明白小鼠胚胎干细胞进行分离、消化传代、培养鉴定等,研究大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养中的作用效果。结果显示,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠3.5d囊胚胚胎干细胞集落分离中,所分离的昆明白小鼠胚胎干细胞集落具有岛屿状生长,隆起于饲养层上;碱性磷酸酶染色为强阳性;体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;经过常规冻存传代的胚胎干细胞集落具有较为一致的生长形态,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;对传至第5代的小鼠胚胎干细胞集落进行核型分析,小鼠胚胎干细胞核型正常率大于75%。试验证实,SD大鼠心肌条件培养基在昆明白小鼠胚胎干细胞分离培养过程中效果较好。     

山羊类胚胎干细胞的分离、克隆研究

从胚胎发育阶段、饲养层、生长因子等方面对影响山羊胚胎干细胞的分离、克隆的因素进行了研究。结果表明：囊胚期可作为分离山羊胚胎干细胞收集胚胎适宜阶段；小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和山羊胚胎成纤维细胞(GEF)对山羊类ES细胞分离效果影响不明显；生长因子LIF和SCF配合使用可分离到山羊的类ES细胞，并传至第4代。     

人类胚胎干细胞研究述评

对人类胚胎干细胞(hESCs)的来源、培养方法、建系条件、生物学特性和鉴定方法、遗传操作及其需解决的问题进行了讨论。提出目前研究的重点在于揭示维持ES细胞多能性和自我更新的机理,进一步优化人类和其他哺乳动物类ES细胞的分离、培养、建系方法,探讨其定向分化机理,建立胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)的大规模快速扩增技术;完善hESCs向重要功能细胞(生殖细胞)分化的体系;单细胞比对分析ESCs、畸胎瘤细胞(ECSs)、EGCs、类胚体(EBs)、各级生殖细胞和成体细胞的基因及蛋白表达图谱,以探求生殖细胞、成体细胞、ESCs、ECSs、EGCs的本质区别,积极开展将ES细胞用于治疗人类疾病模型的研究。     

大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞分离培养效果的影响

采用大鼠心肌细胞条件培养基对兔胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)进行分离、传代培养,研究大鼠心肌细胞条件培养基对兔ESC分离培养效果的影响。结果显示,用SD大鼠心肌细胞条件培养基培养的兔ESC集落呈岛屿状生长,碱性磷酸酶染色呈强阳性,体外分化可形成类胚体状结构,贴壁的类胚体周边会出现许多分化的上皮样细胞或单个散在的细胞;常规冻存后再传代的兔ESC集落具有较为一致的生长特征,并呈现胚胎干细胞集落所特有的岛屿状生长形态;传至第5代的兔ESC集落核型正常率>75％。表明SD大鼠心肌细胞条件培养基可用于兔胚胎干细胞分离培养。