山羊卵母细胞冷冻保存技术研究

检测不同冷冻保护剂(PROH、DMSO、甘油)及不同冷冻方法(程序冷冻法、OPS玻璃化冷冻法)对山羊卵母细胞发育情况.结果表明,PROH(GV:85.3%;IVM:85.4%)和DMSO(GV:82.2%;IVM:85.2%)对各期卵母细胞的正常形态保护能力无显著性差异(P>0.05),但均显著高于甘油(GV:70.4%;IVM:75.5%)(P<0.05).以PROH作为冷冻保护剂,其GV期卵母细胞成熟率(27.2%)均显著高于DMSO(18.9%)和甘油(10.1%)(P<0.05);IVM卵母细胞受精率(25.6%)也显著高于DMSO(18.7%)和甘油(14.1%)(P<0.05).常规程序冷冻和OPS玻璃化冷冻法,GV期卵母细胞的成熟率分别为21.3%和29.9%,受精率分别为6.3%和9.1%;培养9 h卵母细胞的成熟率分别为20.5%和32.0%,受精率分别为5.1%和10.7%;IVM卵母细胞的受精率分别为21.4%和30.3%,2-细胞率分别为4.8%和10.5%;不论是常规程序冷冻还是OPS玻璃化冷冻,GV期和培养9 h卵母细胞的成熟率和受精率差异不显著(P>0.05),但受精率均低于IVM卵母细胞(P<0.05).结果显示,PROH作为山羊卵母细胞的冷冻保护剂,其保护作用明显优于DMSO及甘油;OPS玻璃化冷冻效果要明显优于常规程序法.     

猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存技术研究

旨在探讨提高猪GV期卵母细胞冷冻保存效率的可能途径。将EDS、EFS40和ES冷冻保护液用作卵母细胞冻前、冻后程序的处理,但不冷冻,比较3种冷冻保护剂对猪GV期卵母细胞的毒性作用;采用ES液作玻璃化液,比较常规细管法、OPS法和电镜铜网法3种冷冻载体对猪GV期卵母细胞的冷冻效果;并以ES液作玻璃化液,OPS管为冷冻载体,将猪GV期卵母细胞分5组,即对照组、CB+离心处理组、直接冷冻组、CB+冷冻组、CB+离心+冷冻组进行对比处理,比较各处理卵母细胞的冻后存活率与发育率。结果表明,在不同冷冻保护液中,以ES液组合作为玻璃化冷冻液时的毒性作用最低,与对照组间无明显差异(P>0.05);在3种冷冻载体中,用OPS法冷冻猪GV期卵母细胞,所获冻后存活率明显高于电镜铜网法和细管法(65.4%对45.0%和38.6%,P<0.05),并可获得最佳的冻后成熟率(43.3%);猪GV期卵母细胞单纯经细胞松弛素B和离心极化处理,不会严重影响卵母细胞的存活,但卵裂率显著低于对照组(39.0%对52.1%,P<0.05);细胞松弛素B处理或细胞松弛素B+离心极化处理后再进行玻璃化冷冻,并不能提高卵母细胞的冻后存活率与发育率。采用OPS法直接进行GV期卵母细胞的玻璃化冷冻,可获得7.8%的冻后卵裂率,并能获得桑椹胚发育,是一种有效的猪卵母细胞冷冻保存技术。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化

为研究猪未成熟期(GV期)和体外成熟期(MⅡ期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化,随机取新鲜与冷冻-解冻后的GV期和MⅡ期卵母细胞制备电镜标本.GV期和MⅡ卵母细胞分3组进行处理:Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为GV期卵母细胞冷冻组,Ⅲ组为MⅡ期卵母细胞冷冻组.结果表明,所用玻璃化冷冻程序更适用于猪GV期卵母细胞的冷冻保存,GV期冷冻组卵母细胞的二乙酸荧光素(FDA)染色存活率、卵裂率均明显高于MⅡ期卵母细胞冷冻组.透射电镜观察结果发现,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,主要表现为部分卵丘-卵母细胞复合体(COC)发生卵丘细胞脱落,透明带破损,卵丘细胞碎裂,卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏,卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少,卵母细胞内脂滴多呈均质状.而MⅡ期卵母细胞冷冻后,皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下,仅可见形态不规则的不均质脂滴,其周围常严重空泡化.试验表明,采用适当的冷冻方案,可以获得少量源于冷冻保存的猪GV期卵母细胞的胚胎.而猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,经体外受精未见卵裂,脂滴严重空泡化是其最为明显的变化.     

小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及胚胎发育的影响

【目的】探讨小檗碱对玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量及体外受精胚胎发育效果的影响。【方法】体外成熟液和胚胎培养液中添加小檗碱为Ber组,未添加小檗碱为对照组,MII期卵母细胞进行冷冻液处理为冷冻液处理对照组和冷冻液处理+Ber组;采用开放式拉长塑料细管法对卵母细胞玻璃化冷冻与解冻,试验各组别为GV期冷冻组、GV期冷冻+Ber组、MII期冷冻组、MII期冷冻+Ber组。观察卵母细胞体外成熟效果及其体外受精胚胎体外发育效果;观察卵母细胞冷冻化学损伤存活率及其体外受精胚胎发育率;采用尼罗红染色法观察卵母细胞中脂滴含量,观察卵母细胞玻璃化冷冻解冻后存活率及其体外受精胚胎发育率;利用差异染色法和TUNEL法计数囊胚内细胞团和细胞总数以及细胞凋亡数。【结果】Ber组能够极显著促进猪卵母细胞体外成熟,显著降低猪卵母细胞玻璃化冷冻的化学损伤,促进猪卵母细胞冷冻解冻后的细胞存活率,而猪MII期卵母细胞相对于GV期卵母细胞具有很好的冷冻解冻后的存活率;小檗碱能降低猪卵母细胞玻璃化冷冻后的脂滴含量,MⅡ期卵母细胞冷冻前后脂滴含量均低于GV期冷冻前后;小檗碱能够促进猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻解冻后的体外成熟,且有利于猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后早期胚胎的发育,相对于冷冻MII期卵母细胞,冷冻GV期卵母细胞具有更好的体外发育效果;小檗碱能够提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外发育囊胚内细胞团数与细胞总数,降低其细胞凋亡,有利于提高猪卵母细胞玻璃化冷冻解冻后体外受精胚胎发育至囊胚的质量。而GV期相对MII期则冷冻效果更佳。【结论】小檗碱能够通过降低玻璃化冷冻猪卵母细胞脂滴含量,从而提高其冷冻解冻后体外成熟率和体外受精胚胎发育质量;GV期玻璃化冷冻卵母细胞相对于MII期,在冷冻解冻后其体外受精胚胎发育质量有更好提高。相关机制还有待今后进一步研究。     

猪卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化

为研究猪未成熟期(GV期)和体外成熟期(MⅡ期)卵母细胞玻璃化冷冻后的超微结构变化,随机取新鲜与冷冻-解冻后的GV期和MⅡ期卵母细胞制备电镜标本.GV期和MⅡ卵母细胞分3组进行处理:Ⅰ组为对照组,Ⅱ组为GV期卵母细胞冷冻组,Ⅲ组为MⅡ期卵母细胞冷冻组.结果表明,所用玻璃化冷冻程序更适用于猪GV期卵母细胞的冷冻保存,GV期冷冻组卵母细胞的二乙酸荧光素(FDA)染色存活率、卵裂率均明显高于MⅡ期卵母细胞冷冻组.透射电镜观察结果发现,猪GV期卵母细胞经玻璃化冷冻后,主要表现为部分卵丘-卵母细胞复合体(COC)发生卵丘细胞脱落,透明带破损,卵丘细胞碎裂,卵丘细胞与卵母细胞间的连接受到破坏,卵母细胞微绒毛断裂、消失、数量减少,卵母细胞内脂滴多呈均质状.而MⅡ期卵母细胞冷冻后,皮质颗粒仍呈单层排列于质膜下,仅可见形态不规则的不均质脂滴,其周围常严重空泡化.试验表明,采用适当的冷冻方案,可以获得少量源于冷冻保存的猪GV期卵母细胞的胚胎.而猪MⅡ期卵母细胞冷冻后,经体外受精未见卵裂,脂滴严重空泡化是其最为明显的变化.     

利用冷冻的GV期卵母细胞制备延边黄牛核移植胚胎的研究

研究使用玻璃化冷冻、程序化冷冻和超快速冷冻3种方法冷冻延边黄牛的卵母细胞,确定适宜的延边黄牛核移植受体卵母细胞的冷冻方法。结果显示,3种冷冻方法处理的GV期卵母细胞在成熟率上相似,玻璃化冷冻法得到的卵母细胞形态正常率要高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),超快速冷冻法回收率最低。采用玻璃化冷冻法,核移植重组胚卵裂率明显高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),在融合率上,3种方法差异不显著。表明玻璃化冷冻方法对延边黄牛GV期卵母细胞冷冻效果优于程序化冷冻和超快速冷冻方法,是一种较适合延边黄牛核移植的卵母细胞冷冻方法。     

绵羊卵母细胞OPS玻璃化冷冻效果初报

比较了绵羊卵母细胞不同发育阶段对OPS玻璃化冷冻效果的影响,同时比较了程序化冷冻与OPS玻璃化冷冻的效果。结果显示:成熟培养0h(GV期)、16h、24h、26h的卵母细胞玻璃化冷冻、解冻后形态正常数差异不显著()P<0.05),培养24h卵母细胞冷冻保存后,分裂卵数、囊胚发育数与培养0h、16h、26h试验组差异显著(38.3%VS13.3%、26.7%、28.3%;11.7%VS0%、5.0%、8.3%,P<0.05),而培养16h、26h两个试验组之间差异不显著(P<0.05);程序化冷冻方法(参考胚胎程序化冷冻)、OPS玻璃化冷冻与不冷冻三组试验在形态正常数、分裂卵数和囊胚发育数上差异都极显著(20.0%VS54.1%、100%;6.7%VS37.5%、78.3%;0%VS11.4%、23.3%,P<0.01)。     

抗冻剂、CB和离心极化对猪GV期卵母细胞冷冻效率的影响

【目的】评价2种冷冻保护剂(EDS和EPS)、细胞松弛素B(CB)和离心极化处理对猪GV期卵母细胞冷冻效果的影响。【方法】分别应用EDS和EPS 2种冷冻保护剂、CB(设5.0,7.5和10.0μg/mL 3个水平)和离心极化处理,对猪卵母细胞进行玻璃化冷冻保存,解冻后用台盼蓝染色法和Hochest33342染色法分析猪卵母细胞存活率及随后的成熟率。【结果】EPS组和EDS组冻融后的猪卵母细胞存活率和成熟率均无显著差异。以EPS作冷冻保护剂时,冻融后裸卵组的存活率显著高于COCs组(P<0.05)。7.5μg/mL CB处理组的裸卵存活率显著高于对照组(P<0.05);7.5μg/mL CB+离心极化处理组裸卵存活率与成熟率均显著高于CB单处理组和对照组(P<0.05)。【结论】同等条件下,猪GV期裸卵的冷冻效果好于COCs;CB或CB+离心极化均能改善GV期猪卵母细胞冷冻效果。     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞体外发育能力的影响

采用猪未成熟(GV期)和体外成熟(MⅡ期)卵母细胞分组进行冷冻保护剂毒性试验,试验组经冷冻液处理,对照组不用冷冻液处理。结果表明,GV期与MⅡ期卵母细胞相比,两者经冷冻保护剂处理后,其存活率、体外受精胚卵裂率均无显著差异(P>0.05);试验组GV期卵母细胞存活率、体外成熟率及体外受精胚卵裂率虽略低于对照组(85.9%,72.4%和50.9%对91.3%,73.9%和53.3%),但差异不显著(P>0.05);试验组MⅡ期卵母细胞存活率虽显著低于对照组,但卵裂率与对照组无显著差异(P>0.05)。表明所用冷冻液及其处理程序,对卵母细胞无明显毒性。分3组对猪卵母细胞进行冷冻保存试验:I组为对照组;II组为GV期卵母细胞冷冻组;III组为MⅡ期卵母细胞冷冻组。结果表明,经开放式拉管(Open pulled straw,OPS)法玻璃化冷冻后,GV期和MⅡ期卵母细胞均获得较高的形态正常率,但GV期卵母细胞冷冻后存活率要显著高于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。经玻璃化冷冻后,GV期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均明显低于新鲜卵母细胞(42.6%和7.79%对73.9%和53.3%,P<0.05),MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后未获得卵裂。在GV期卵母细胞冷冻组,154枚卵母细胞冷冻后经体外成熟、体外受精及体外培养,共有12枚发生卵裂,其中6枚发育至8-细胞,3枚发育至16-细胞,3枚发育至桑椹胚。本研究表明,所用冷冻方案更适合于猪GV期卵母细胞的冷冻保存。     

猪卵母细胞、胚胎玻璃化冷冻初步研究

本试验研究了不同冷冻承载工具,玻璃化溶液处理时间和不同发育阶段对猪卵母细胞超低温冷冻保存的影响。(1)比较凝胶上样管(gel-loadingtip;GLT)、开放式拉长麦管(openpulledstraw;OPS)、玻璃微细管(glassmicropipette;GMP)保存法对卵母细胞冷冻效果的影响。(2)比较在EFS40中处理30s,1min,2min对卵母细胞冷冻效果的影响。(3)比较MII期和GV期的卵母细胞冷冻效果。结果表明,(1)GLT法体外存活率为52.8%略优于OPS法(50.5%)和GMP法(51.1%)。(2)解冻后30s组和1min组的体外存活率分别为48.82%、43.9%,显著优于2min组的18.8%(p<0.05)。(3)解冻后MII期体外存活率为53.6%,显著优于GV期的22.0%(p<0.05)。(4)冷冻对猪卵母细胞的发育潜能影响较大,用新鲜精液进行体外受精,仅有4.9%的受精卵分裂,极显著低于对照组的49.5%(P<0.01);并且发育至4细胞期的比例为1.7%,未能发育至8细胞期。胚胎在25%VS1冷冻液中平衡20分钟后将胚胎在65%VS1冷冻液中平衡20秒,然后将胚胎再放入到100%VS1冷冻液中在30秒的时间内装入GLT管投入到液氮中进行保存。扩张囊胚的冷冻效果要明显优于孵化囊胚。     

OPS玻璃化冷冻对山羊卵母细胞超微结构的影响

对山羊不同发育阶段卵母细胞ＯＰＳ玻璃化冷冻的超微结构损伤进行了电镜观察。结果表明，卵丘细胞除内质网扩张外，未见其他明显的结构损伤；卵母细胞的质膜损伤以ＧＶ期最为严重，其次为培养９ ｈ的，ＩＶＭ 的最轻；ＧＶ期卵几乎看不到微绒毛，而培养９ ｈ和ＩＶＭ卵微绒毛保存较好；ＧＶ期卵母细胞线粒体有的发生了损 伤，主要表现在嵴不清或扩张，培养９ ｈ和ＩＶＭ卵母细胞的线粒体基本上保持了正常的结构；培养９ ｈ卵母细胞的 内质同发生了扩张，ＩＶＭ卵母细胞内质网结构正常。     

不同月份猪卵母细胞体外成熟效果比较

【目的】分析卵母细胞发育与不同季节（月份）的相关性,为提高猪卵母细胞的体外成熟效率奠定基础。【方法】2012年2～6月从南宁市某屠宰场收集猪卵巢采集卵母细胞,经体外成熟（IVM）40-44h,然后随机挑出成熟后的卯母细胞进行地衣红染色,相差显微镜下观察、记录卵母细胞发育成熟的各个时期,并分析卵母细胞发育时期与不同月份温度、湿度的相关性。【结果】随着月份的增加,GV期和GVBD期卵母细胞所占比例整体上呈下降趋势,AT期所占比例呈上升趋势,除5月外,MII期所占比例整体上也呈上升趋势,6月MII期所占比例最高,为42．31％。2、3、4月的GVBD期所占比例显著高于6月所占比例（4．40％）（P〈0．05）。从卵母细胞发育时期与不同月份温度、湿度的相关性分析结果可知,GV期、GVBD期、MI期3个时期与温度变化呈负相关,与湿度变化呈正相关;而AT期、MII期与温度变化呈正相关,与湿度变化呈负相关。【结论】不同月份猪卵母细胞的ⅣM效果存在一定差异。在高湿低温月份,GV期和GVBD期的卵母细胞所占比例较大,MII期所占比例较小;而在低湿高温月份,Gv期和GVBD所占比例较小,MII期所占比例较大。     

VE对犬卵母细胞体外成熟的影响

在基础培养液中分别添加浓度为0,50,100,200μmol/L的VE,研究不同浓度VE对成熟情况的影响。结果表明,体外培养48h后VE浓度为50μmol/L组GV期的比率显著高于100和200μmol/L组(P<0.05);100μmol/L组GVBD期的比率显著低于其它组(P<0.05);达到MI-MII期的比率各组之间差异不显著(P>0.05),但100μmol/L组MI-MII期的比率相对较高。体外培养72h后,VE浓度为200μmol/L组的GV期的比率显著高于对照组和100μmol/L组(P<0.05),与50μmol/L组之间差异不显著(P>0.05);达到GVBD和MI-MII期的比率各组之间均差异不显著(P>0.05)。因此,VE对犬卵母细胞的核成熟没有明显促进作用。     

小檗碱对猪卵巢卵母细胞体外成熟及其脂滴含量和分布的影响

[目的]探明不同形态的猪卵巢中卵母细胞体外成熟效果与脂滴的相关性,以及小檗碱对其的影响.[方法]将卵泡型卵巢GV期和黄体型卵巢GV期卵母细胞分别用添加小檗碱的成熟液体外成熟,观察体外成熟效果;用尼罗红染色的方法测定成熟前后的卵母细胞的脂滴含量,并观察成熟后各组卵母细胞脂滴的分布.[结果]卵泡型卵母细胞的颗粒细胞扩散率和第一极体排出率均显著高于黄体型卵母细胞(P＜0.05),小檗碱(Berberine,Ber)组卵母细胞的颗粒细胞扩散率显著高于对照组(P＜0.05),第一极体排出率极显著高于对照组(P＜0.01);体外成熟后,对照组卵母细胞中脂滴含量显著降低(P＜0.05),小檗碱组极显著降低(P＜0.01),且极显著低于对照组(P＜0.01).黄体型卵母细胞的脂滴含量则显著低于卵泡型(P＜0.05).猪卵母细胞成熟后的脂滴分布为分散型、外围型和不规则型,卵泡型卵母细胞脂滴主要呈分散分布,黄体型卵母细胞脂滴主要呈外围分布,并且黄体型卵母细胞脂滴呈不规则分布多于卵泡型.[结论]小檗碱能明显促进猪卵母细胞体外成熟,且卵泡型成熟效果显著好于黄体型;体外成熟后,卵母细胞脂滴逐渐减少,小檗碱组脂滴含量极显著减少,且黄体型卵母细胞脂滴含量明显减少;猪卵母细胞内脂滴的分布与卵巢所处的时期有关.     

卵巢皮质与输卵管上皮细胞对猪卵母细胞体外成熟与体外受精的影响

在猪输卵管上皮细胞（pOECs）与猪卵巢皮质细胞（pOCCs）共培养体系中进行猪卵子体外成熟（IVM）,研究比较了pOECs与pOCCs对猪卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精与胚胎发育的影响。结果显示：pOCCs或pOECs参与猪卵子体外成熟可显著提高卵丘扩散与MⅡ期卵子的比例（P<0.05）,然而GV期卵子的比例却没有显著减少（P>0.05）;pOCCs组内成熟卵子的GSH含量显著高于其余各组（P<0.05）,而GSH在pOECs组与对照组之间差异不显著（P>0.05）;尽管pOCCs和pOECs共成熟可显著降低多精入卵的比例（P<0.05）,但是受精率与雄原核形成率（MPN）在各组间却无显著差异（P>0.05）;pOCCs和pOECs共培养均可以显著提高卵裂率与囊胚发育率（P>0.05）,然而囊胚细胞数在处理组与对照组间没有显著性差异（P>0.05）。研究认为,pOCCs与pOECs共培养体系能显著提高猪卵母细胞IVM质量,降低多精入卵的发生,并提高囊胚发育率。     

生发泡移植过程对小鼠卵母细胞体外受精的影响

为研究生发泡(GV)移植后的重组卵母细胞能充分在体外成熟和发育,本试验比较了GV移植过程及体外成熟对小鼠卵母细胞体外受精的影响。通过透明带切口及GV移植获得的重组GV期卵母细胞的成熟率为87.0%(147/169),体外受精后发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率分别为76.2%(112/147)和42.2%(62/147),与仅做透明带切口但不进行GV移植的对照组相似(P>0.05),表明GV移植过程未对卵母细胞体外受精后的早期胚胎发育能力产生不利影响。但与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟卵母细胞的受精率和卵裂率都明显降低,表明其进一步发育的能力受到影响。     

猪卵母细胞冷冻保存研究

【目的】本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型，从而有效地保存猪卵母细胞;【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素（FDA）染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】（1）程序化法冷冻保存中，9%乙二醇（EG），10%二甲基亚砜（DMSO），10%甘油（Gly）均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用，极显著高于对照组（FDA染色成活率33.8%，25.8%，23.5% vs 2.5%，P <0.01），且以9%EG的效果最好，显著高于另外两组（ 33.8% vs 25.8%，23.5%, P <0.05）。（2）玻璃微细管（GMP）法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法，以普通的麦管（Straw）法进行的程序化冷冻为对照组，GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率（分别为63.3%和34.5%，P<0.05）。（3）在玻璃化冷冻方法中，不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液，Straw和GMP管作冷冻液载体，卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%，二者差异显著（P <0.05）。（4）用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著（成活率分别为30.0%和59.7%，P<0.05）。冷冻后继续培养，分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。（5）冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4.9%的受精卵分裂，极显著低于对照组的49.5%（P<0.01）；发育至4-细胞期的比例为1.7%，但未能发育至8-细胞期以上胚胎。【结论】选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞，为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。