野猪源与家猪源PRRSV陕西流行毒株对仔猪的致病性试验

【目的】研究野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株对易感仔猪的致病性及发病规律,进一步弄清PRRSV变异株的病原特征及其与"猪高热病"发生的关系。【方法】选取PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)抗原、抗体检测均为阴性的健康仔猪(40日龄)9头,随机分为3组,用家猪源Shaanxi-1及野猪源Shaanxi-2 PRRSV变异株分别感染其中一组仔猪,每头肌注6 mL,滴鼻2 mL;另一组作为阴性对照,按相同剂量和方法接种正常Marc-145细胞处理液。攻毒后各组分圈饲养,每天定时测量体温,绘制体温变化曲线,观察临床症状,记录发病情况。攻毒后采血及咽喉、眼、鼻分泌物和粪便,采用RT-PCR方法检测PRRSV、猪瘟病毒(CSFV)、PCV2、猪伪狂犬病毒(PRV)核酸,用ELISA试验及血清中和试验检测血清抗体。【结果】Shaanxi-1与Shaanxi-2攻毒组均出现体温升高及典型临床症状,但未见死亡病例;攻毒组CSFV、PCV2、PRV核酸检测均为阴性,咽喉、眼、鼻分泌物和粪便在一定时间段可检测到PRRSV核酸;PRRSV特异性抗体检测均为阳性,仅Shaanxi-2攻毒组在第35天检测到中和抗体;Shaanxi-2与Shaanxi-1相比,感染猪的体温较高,临床症状明显,病毒血症的维持时间较长,抗体水平较高。【结论】野猪源Shaanxi-2及家猪源Shaanxi-1 PRRSV变异株对易感仔猪具有一定的致病性,能使感染动物发病但不能致死,Shaanxi-2毒株的致病性相对较强。攻毒后第7天出现病毒血症,持续14～21 d后逐渐消退,仔猪感染PRRSV变异株后,病毒可通过鼻、眼、咽喉分泌物及粪便等排出,其中鼻分泌物排毒最早、排毒时间最长,眼、咽喉分泌物与鼻分泌物、粪便相比排毒较晚、持续时间较短。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒17-ZJ-HZ毒株的分离鉴定与分子流行病学分析

杭州某猪场断奶仔猪群出现高热、呼吸困难等症状,疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染,3头病猪肺脏病变样本送本实验室检测,通过RT-PCR方法检测其病原核酸。肺脏匀浆液无菌处理接种到MARC-145细胞,细胞病变观察、Western-blot、间接免疫荧光等方法验证PRRSV病毒分离情况;RT-PCR方法分五段扩增获得全长病毒基因组序列,采用MEGA等软件分析该毒株的核苷酸序列以及GP5、NSP2氨基酸序列;分离病毒接种3日龄PRRSV阴性仔猪,评价该病毒的毒力。结果表明:该场送检样品为PRRSV阳性;成功分离得到17-ZJ-HZ病毒;获得15 325 bp的 PRRSV全基因组序列。序列分析表明,该毒株与经典北美株的NSP2存在典型的29+1个氨基酸的缺失,且进化分析归于HP-PRRSV亚群。攻毒60 h后猪只出现典型的PRRSV临床症状和病理变化,以上结果表明该毒株为高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)的北美株。     

人工感染高致病性PRRSV肺脏的病理学观察和扫描电镜的形态学变化

通过人工感染高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)察猪肺脏的组织病理学变化以及扫描电镜下的形态学变化.将14头健康猪分成试验组和对照组,用高致病性PRRSV变异株感染试验组10头猪.组织病理学变化表明,攻毒猪在第9天以渗出性炎症为主,第14天出现典型的间质性肺炎变化,第28天肺脏间质性肺炎病变基本消失.扫描电镜观察表明攻毒猪第9天肺泡壁破坏严重,肺泡腔内有大量细胞成分;第14天肺泡壁增厚,肺泡间隔出现大量增生的细胞成分,肺泡内壁粗糙并粘附着许多细胞成分.结合组织病理学和扫描电镜同步观察猪高致病性PRRS肺组织的结构变化为研究高致病性PRRSV侵害肺脏组织的机理开辟了一条新途径.     

猪瘟与高致病性蓝耳病混合感染的诊断及病原特性分析

[目的]诊断由猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪伪狂犬病毒（PRV）引发的猪疫病,并分析病原。[方法]采集福建某猪场发病猪的组织器官,提取病毒DNA或RNA,PCR检测病毒感染。采用ELISA方法检测CSFV、PRRSV和PRV的感染情况。[结果]测序分析和ELISA结果表明,猪场存在PRRSV、CSFV、PRV3种病毒感染。[结论]该次猪病疫情主要是由CSFV和高致病性PRRSV混合感染引起。     

猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)SA毒株的分离与鉴定

从仔猪内脏分离到一株猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV）毒株，该毒株能在Marc－145细胞上增殖致细胞病变，该病变能被PRRSV美洲型阳性血清所抑制，不被乙脑病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒阳性血清所抑制，经美洲型PRRSV荧光抗体染色呈阳性反应，电镜观察到直径55nm左右的病毒粒子，属RNA病毒，接种阴性仔猪未见临床症状异常，但血清学阳性。命名该分离毒为PRRSV－SA毒株。     

猪伪狂犬病病毒流行株gE基因的遗传变异分析及其对仔猪致病性的初步研究

[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用 Vero 细胞从疑似伪狂犬病病毒（PRV）引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株 gE基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株 PRV 毒株,命名为 PRV N5B 株,该病毒能在 Vero 细胞上增值,在15代 TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;gE基因全长1740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%～100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒（106/0.1 ml）滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的 PRV N5B分离株 gE基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。     

山羊B组轮状病毒KB－63株动物感染实验

以山羊Ｂ组轮状病毒ＫＢ－６３株（本室分离鉴定）口服接种剥夺初乳的新生山羊羔、绵羊羔、犊牛以及仔猪。该毒株可在接种后１２～１７ｈ内引起山羊羔、绵羊羔，以及犊牛发生急性腹泻，并排出大量病毒，其核酸电泳图型及组抗原检测也与原接种病毒一致。当该毒株接种剥夺初乳仔猪时，不能引起仔猪腹泻也不排出病毒     

猪细小病毒N株免疫期测定

用PPV—N株制备成弱毒疫苗,在配种前1个月接种PPV HI抗体阴性的后备母猪,接种2周后检测PPV HI抗体均达到1：256以上。当怀孕到40d时用PPV强毒攻击,攻毒后40d剖杀的2头怀孕母猪其胎儿正常健活,胎儿心血未检测到PPV HI抗体,胎儿脏器未分离到病毒;自然分娩的2头母猪,其仔猪健活,未吃初乳仔猪PPV HI抗体阴性,仔猪脏器未分离到病毒;而强毒攻击的对照猪均出现不同程度的死胎,并从未吃初乳仔猪检测到PPV HI抗体和从死胎儿肺回收到病毒。按上述方法连续观察到第3胎（免疫后15个月）,证明免疫母猪怀孕到第3胎仍能抵抗PPV强毒攻击,说明PPV—N株对母猪的免疫期达1年以上。     

亚临床症状猪群中PRRSV和PCV2的感染情况

[目的]了解亚临床症状猪群中PRRSV和PCV2的感染情况。[方法]选择7个有PRRSV和PCV2感染史且有亚临床症状的猪群,通过ELISA和PCR的相结合方法检测其PRRSV和PCV2的感染情况。[结果]ELISA检测结果表明,所有猪场12周龄仔猪PRRSV和PCV2抗体能观察到血清抗体转化。PCR结果表明约3/7的猪场8周龄仔猪PRRSV呈阳性,12和20周龄仔猪PRRSV呈阴性;8~20周龄有不同比例仔猪PCV2呈阳性。[结论]在亚临床症状猪群中PRRSV的感染主要在8~12周龄,而PCV2在8~20周龄都有感染。     

荧光定量RT-PCR检测高致病性PRRSV接触感染仔猪增殖动态

为检测高致病性PRRSV接触感染仔猪的增殖动态,建立了荧光定量RT-PCR方法,该方法在模板为2.18×10~1~2.18×10~6拷贝范围内具有良好线性关系,相关系数为0.996,灵敏度比常规RT-PCR高1 000倍,并且与其他猪病病毒无交叉反应;在3头健康仔猪中引入1头PRRSV人工感染猪,定期监测仔猪接触感染PRRSV后病毒血症和排毒水平,研究结果表明,接触感染猪后分别于3、5 d首次在血清和粪便中检出PRRSV,相比人工接种猪推迟2 d,此后7 d内病毒含量迅速上升并维持较高水平直至死亡。本研究为PRRSV在猪体内的定量检测提供了有效手段,为进一步了解PRRSV的传播机制以及建立防治PRRSV感染的仔猪模型提供了基础数据。     

Evaluation of the Pathogenicity of a Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Variant in Piglets

Since May 2006,a highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV) variant characterized by 30 amino acids deletion within its NSP2-coding region emerged and caused extensive economic losses to China's pig industry.To investigate the in vivo pathogenicity and immune responses of the newly emerging PRRSV,3 groups of 60-d-old conventional piglets were inoculated intranasally with a representative strain of the HP-PRRSV variant HuN4 with 3 different infection doses (3× 103-3× 105 TCID50).The results revealed that the virus variant caused severe disease in piglets and the significant clinical characteristics consisted of persistently high fever (41.0-41.9℃) and high morbidity and mortality (60-100％),the marked clinical signs of PRRS and severe histopathogenic damages in multiple organs.It induced rapid and intense humoral immune responses and seroconversion was detected in most infected pigs at 7 d post-infection (DPI).The virus vigorously replicated in vivo and the highest virus average titer was 9.7 log copies mL-1 serum at 7 DPI.Elevated levels of IFN-y and IL- 10 cytokine production in serum in this study were also observed.Taken together,our results demonstrated that the HP-PRRSV variant HuN4 strain is highly pathogenic for piglets and suitable to be a reference strain of highly virulent PRRSV for evaluating the efficacy of the new vaccines.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒TJ株的分离与鉴定

从某猪场发生高热死亡的仔猪病料中分离到1株病毒,该病毒在Marc-145细胞上增殖致细胞病变。经RT—PCR检测证明该分离株为美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。该毒株回归易感动物可产生明显的临床症状,并引起死亡,将其命名为PRRSV TJ毒株。对其Nsp2序列进行扩增测序,结果表明：与美洲标准毒株VR-2332相比,TJ株Nsp2序列缺失第481位和第532～560位氨基酸,二者核苷酸同源性为83．7％,其编码的氨基酸同源性为77．9％。本试验结果表明,该分离株为发生了变异的PRILSV,对猪具有高致病性。     

2种植物多糖对PRRSV灭活苗免疫猪抗体及T淋巴细胞亚群的影响

将24头35日龄断奶仔猪随机分为6组,2种多糖(山药多糖和黄芪多糖)分别以高、低2个剂量(山药多糖剂量17.10、8.55mg/kg,黄芪多糖剂量为11.50、5.75mg/kg)和猪PRRSV灭活苗同时注射,于免疫后不同时间点采血,监测PRRSV抗体水平和外周血中T淋巴细胞亚群的变化.结果表明,2种多糖均能增强免疫猪的体液免疫,其中以高剂量的黄芪多糖效果较好;2种多糖均能促进猪CD3+细胞的增殖,其中以山药多糖效果较好,提示2种多糖对PRRSV灭活苗免疫效果均有较好的增强作用.     

PRRSV诱导猪体内肺泡巨噬细胞炎症模型的建立

[目的]建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)诱导体内猪肺泡巨噬细胞(PAM)炎症模型,评价PRRSV感染对仔猪免疫系统的影响,为猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的临床诊断及科学防控提供参考依据.[方法]以PRRSV-GXNN1396株人工感染30日龄健康断奶仔猪,复制出PRRS病症,剖杀后采集病料,通过组织病理学和RT-PCR检测观察各免疫器官组织的病理变化及其病毒分布情况,并检测PAM细胞内的COX-1、COX-2等酶活性变化及IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、IFN-γ、MCP-1和TNF-α等炎性细胞因子水平变化.[结果]断奶仔猪接种PRRSV-GXNN1396株后第3d开始表现出典型的PRRS病症,PRRSV主要集中在肺脏、颌下淋巴结、血液和扁桃体等样品组织中,攻毒仔猪各主要器官的实质细胞及有关淋巴细胞均出现不同程度坏死和炎症细胞浸入现象,尤其以肺脏、肾脏、脾脏等器官受损严重,出现巨噬细胞和淋巴细胞浸润.PRRSV感染早期(第3d)仔猪PAM细胞中的ROS水平及COX-2、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α等因子水平均呈升高趋势,且COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α因子水平极显著升高(P<0.01);随着感染天数的增加,PAM细胞内的COX-2、IL-6和IL-8因子水平呈下降趋势,TNF-α因子水平呈上升趋势.[结论]成功建立了PRRSV诱导仔猪体内PAM细胞炎症模型,进一步佐证PRRSV主要侵害猪的免疫器官组织,以达到免疫抑制的效果,并推断感染第3d是病猪炎症反应的高峰期.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因对猪的DNA免疫

【目的】检测PRRSV GP5 DNA重组质粒在猪体诱导的免疫反应以及细胞因子的佐剂效应。【方法】将表达PRRSV GP5的DNA重组质粒与表达3种细胞因子的重组质粒联合免疫SPF猪，经3次免疫后人工感染PRRSV，检测体液免疫、细胞免疫以及攻毒保护性反应。【结果】重组质粒pCI-GP5可诱导免疫猪产生中和抗体，效价达1:19.2，并可诱导机体产生较强的细胞免疫，攻毒后组织中PRRSV核酸的检出率下降39%，表明表达PRRSV GP5的DNA重组质粒pCI-GP5可诱导一定的免疫效力。pcDNA-IL-4与pCI-GP5共免可将中和抗体效价提高到1:35.5，且可增强细胞免疫反应，与对照组相比，病毒血症的出现频率减少17%，PRRSV阳性组织检出率下降64%；pcDNA-IL-2与pCI-GP5共免也可增强猪的细胞免疫，与对照组相比，病毒血症的出现频率下降50%，PRRSV阳性组织检出率减少59%； pcDNA-IFN- 与pCI-GP5共免对病毒血症的出现及病毒在组织中的分布均没有抑制作用。【结论】动物试验结果表明IL-4及IL-2可作为PRRSV GP5 DNA重组质粒的免疫佐剂。     

尼罗罗非鱼♀×萨罗罗非鱼人工 杂交卵子、精子形态观察

采集尼罗罗非鱼意伊萨罗罗非鱼杂交中人工挤压亲鱼腹部获得的卵子、精子。用光学显微镜和解剖镜 对卵子形态进行观察、拍照,比较分析不同成熟阶段卵子形状、卵径、表面色泽及卵黄颗粒积累特征,结果表明,未成 熟卵细胞呈椭圆形,表层布满细长血管;成熟卵细胞呈梨形,卵径0.5耀1.6 mm,外层有透明卵膜,充满金黄色卵黄颗 粒;过成熟卵细胞形状极不规则,卵黄颗粒开始液化。用扫描电镜对精子外形特征进行观察,发现正常精子由头部、 中片及尾部组成,头部呈长锥状,长径1.82（依0.35）滋m,宽径1.41（依0.34）滋m;中片近圆柱形、较短,长径0.74（依0.08） 滋m,宽径0.16（依0.06）滋m;尾部极长,为16.42（依0.35）滋m,单鞭毛结构;同时,还观察到短尾、双头、双尾3 种异常类 型。研究结果可为罗非鱼人工杂交技术改进提供一定基础依据。     

河南地区NADC30-like PRRSV毒株的增殖特性与遗传进化分析

为研究河南地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行特点和遗传变异情况,采集河南省滑县地区猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场中的病料,经研磨、稀释、离心处理后将悬液上清接种于原代猪肺泡巨噬细胞,进行病毒分离培养,结果显示,PAM出现典型细胞病变效应,将得到的分离株命名为HNhx。应用PRRSV N蛋白的特异抗体进行间接免疫荧光(IFA)试验,结果表明,接种HNhx分离株的PAM出现特异性荧光,证明该分离株为PRRSV。应用RT-PCR技术对Nsp2区进行扩增分析,根据扩增目的产物大小推测HNhx分离株为NADC30-like毒株。遗传分析发现,与其他参考毒株相比,HNhx毒株的ORF3、ORF4和ORF5基因与NADC30毒株的同源性最高。基于ORF3、ORF4和ORF5序列构建进化树,系统进化分析的结果表明,HNhx归于NADC30-like亚群。     

饲料中效美素对仔猪生产性能和经济效益的影响

[目的]了解饲料中添加效美素对仔猪增重和饲养经济效益的影响。[方法]以1 303头三元杂交仔猪分组进行饲养试验,试验组日粮中添加效美素30 mg/kg。[结果]效美素组、对照组的仔猪日增重分别为432.43和415.65 g/d,试验组料重比略低于对照组;试验组、对照组的仔猪头均盈利分别为70.55和62.42元/头。[结论]在仔猪饲料中添加30 mg/kg效美素,可以明显促进仔猪生长,提高经济效益。     

Immune Responses to the Attenuated Mycoplasma hyopneumoniae 168 Strain Vaccine by Intrapulmonic Immunization in Piglets

To investigate the immune responses to the attenuated Mycoplasma hyopneumoniae 168 strain vaccine, 8-15 d old piglets were immunized with M. hyopneurnoniae 168 strain vaccine by intrapulmonic route. And the specific IgG antibody in serum, lymphoproliferation, IFNT, and specific secretory IgA （SIgA） antibody in bronchoalveolar lavage fluid were detected on 30 and 60 d post-immunization （DPI）, respectively. On 60 DPI, all the pigs except for those in health control group were challenged with a field M. hyopneumoniae strain JS. Necropsy was performed on 30 d post-challenge （DPC）. The results showed that IFN7 and specific SIgA were stimulated on surface of respiratory tract after immunization. And peripheral blood mononuclear cells could also be proliferated about 1.81 and 2.12 fold on 30 and 60 DPI when stimulated by M. hyopneumoniae protein in vitro. However, no serum IgG antibody against M. hyopneumoniae was detected during the whole immune phage. After challenge, vaccinated pigs were observed with only very slight histological lesion in individual lobes. None of vaccinated pigs showed any clinical signs. While the unvaccinated pigs from challenge control group showed varying degrees of clinical sign and severe macroscopical lesion of mycoplasmal pneumonia of swine （MPS）. The result suggested that the attenuated M. hyopneumoniae 168 strain vaccine inoculated by intrapulmonic route could activate the systemic cellular immunity, the local mucosal immunity and IFNγ secretion in respiratory tract to against M. hyopneumoniae infection in piglets.