SYNGR2影响猪圆环病毒2型体外增殖的研究

宿主的Synaptogyrin-2(SYNGR2)蛋白影响猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的感染能力。本研究旨在研究宿主因子SYNGR2对PCV2在细胞水平增殖的影响，并进一步对SYNGR2影响PCV2体外增殖的机制进行探究。本研究利用基因敲除、过表达、定点突变等手段，在PK15细胞上研究SYNGR2基因敲除及其p.Arg63Cys点突变对PCV2增殖的影响。为探究SYNGR2参与PCV2感染的具体机制，作者对SYNGR2基因敲除的细胞及野生型对照细胞进行转录组测序，筛选SYNGR2功能相关的基因及通路，根据差异表达基因进行表达模式聚类分析，并通过实时荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)验证差异表达基因的表达情况。结果显示，SYNGR2基因敲除或p.Arg63Cys点突变显著降低PCV2对PK15细胞的感染能力，对敲除细胞过表达不同基因型的SYNGR2,PCV2的增殖能力均恢复。转录组差异表达基因分析结果显示，SYNGR2的功能主要是参与膜成分及囊泡等被膜细胞器的组成。对差异表达基因肌球蛋白VIIA与Rab互作蛋白(...     

猪圆环病毒1型ORF2基因的改造及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计合成了一对引物,对PCV1ORF2基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF2基因(702bp)克隆入pMD18-T载体,筛选获得重组质粒命名为pMD-ORF2。由于ORF2前面有120多个信号肽和序列中有大量的稀有密码子,所以将ORF2进行改造并将改造的ORF2双酶切产物插入原核表达载体pET-32α与pET-41α,得到重组子命名为pET-ORF2-1与pET-ORF2-2。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Westernblot分析,结果表明PCV1-ORF2在pET-32α和pET-41α中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子量约为30Kda和45Kda。     

猪2型圆环病毒广东株ORF2基因在大肠埃希氏菌中的表达

应用PCR扩增猪2型圆环病毒广东株ORF2后部一段基因，将PCR产物用K pn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后与同样处理过的pBAD／g ⅢB载体连接，转化TOP10细胞后挑取阳性克隆，酶切鉴定和测序后，用L-阿拉伯糖诱导，经SDS-PAGE和Western-blotting分析，表明ORF2基因在大肠埃希氏菌中得到了表达，表达的多肽为28 ku。     

猪渗出性皮炎病原的分离鉴定

从广东省棠下、增城等地区猪场送检病料中,分离到9株葡萄球菌, 经TH-16S细菌生化编码系统鉴定表明,其中4株松鼠葡萄球菌,3株木糖葡萄球菌,2株猪葡萄球菌.参考Genebank中登录的基因序列,设计合成可区分4种猪葡萄球菌表皮脱落毒素ExhA、ExhB、ExhC、ExhD的引物,并以此引物对2株猪葡萄球菌和其余7株葡萄球菌进行了 PCR检测,结果表明1株为ExhB型,1株为无毒力型,其余7株葡萄球菌均不能产生表皮脱落毒素,用此9株葡萄球菌回归动物后证实,ExhB毒力型的猪葡萄球菌致病力强,很快死亡;无毒力型的猪葡萄球菌无致病力;4株松鼠葡萄球菌都有不同程度的致病性;3株木糖葡萄球菌无致病力,说明猪渗出性皮炎的发生与猪葡萄球菌所产生的表皮脱落毒素有关.     

猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)Cap重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,获得了3株分泌PCV2-Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7,其染色体平均数为98～103,间接ELISA检测3株细胞培养上清效价分别为1:3125、1:3125、1:15625,小鼠腹水效价分别为1:390000、1:390000、1:1950000.ELISA结果显示,1C7A4、4F3F5和4G87F仅与融合表达的PCV2-Cap蛋白反应,而与PET-32a载体表达的蛋白不反应.相加ELISA结果显示3株单克隆抗体对应两个不同的病毒抗原位点.间接免疫荧光结果显示,1C7A4、4F3F5和4G8F7能与PCV2发生反应,而不与PCV1发生交叉反应.结果表明所获得的3株单抗是PCV2型特异性的,为PCV1和PCV2鉴别诊断方法的建立奠定了基础.     

猪红斑丹毒丝菌GZ株的分离鉴定及序列分析

2013年11月从广州某猪场发生急性败血症死亡的母猪心脏、肺脏、脾脏分离到1株病原菌,经形态学观察、培养特性、生化特性及16SrRNA、spaA基因测序,确定为猪红斑丹毒丝菌,命名为GZ株。结果表明,该菌株对阿莫西林、利福平、庆大霉素、头孢类抗生素高度敏感,对其他药物广泛耐药,对BALB/c小鼠的致死剂量为1.5×108 cfu/mL。测序结果与NCBI收录的猪红斑丹毒丝菌进行Blast比对分析,16SrRNA基因与不同地区分离自人、蛋鸡、猪、白海雕、野猪、野兔、鼠等动物的同源性为95.9%~99.8%。spaA基因与NCBI收录的分离菌株核苷酸同源性为98.9%~99.9%,氨基酸同源性为99.5%,3处发生突变,其中,第36位缬氨酸突变为亮氨酸,第203位异亮氨酸突变为蛋氨酸,第257位亮氨酸突变为异亮氨酸;与1998年和2006年日本1a型Fujisawa株的核苷酸同源性最高,为99.8%,因此确定分离的GZ株为1a血清型。     

广东省猪伪狂犬病时间分布和空间分布的研究

为了研究猪伪狂犬病（PR）的流行病学，对1998-2004年间广东省PR血清流行的时间和空间分布进行了调查．结果表明：东莞、惠州、深圳、阳江、珠海的PR血清阳性率较高（〉20％），清远和汕尾地区最少（〈10％），最高地区是最低地区的3．82倍．有51．7％猪场血清阳性率分布在10％以下．PR血清流行在时间序列有每隔5个月出现1个峰值的可能（P〉0．05）．通过ARIMA模型预测，2005年1月广东省的PR血清阳性率为14．23％，与真实值15．06％符合得较好．时间-空间对应分析表明：2002、2003年为珠江三角洲PR流行的高峰期，粤北在2001年为高发年份；2002、2003年，PR的流行率均以粤东为最低．二维对应分析图概括了原始信息量的83．3％．     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物     

NDV融合蛋白裂解位点基因的重组昆虫杆状病毒表达载体的构建与鉴定

将新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株和ＬａＳｏｔａＥ４株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因从本实验室构建的重组质粒ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ中用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ切出。将这２个毒株的Ｆｃ基因定向克隆入昆虫杆状病毒表达载体ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株的Ｆｃ基因克隆ｐＸ３Ｆ４６Ｆｃ和ｐＸ３ＬａＦｃ。重组质粒用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ酶切法、ＰＣＲ和核酸探针法进行了鉴定，证明插入的基因来自ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵ－ＣＬａＦｃ，插入的位置和方向都正确。这２个载体的构建为Ｆｃ基因在昆虫细胞系统的表达创造了条件。     

畜禽疫苗研究现状名词诠释及分类

畜禽疫苗研究现状名词诠释及分类宋长绪，杜伟贤（广东省农业科学院兽医研究所广州５１０６４０）在现代集约化畜牧业中，传染病的预防占有特别重要的地位。对传染病的预防目前最主要最有效的手段是疫苗接种。现在所使用的疫苗可以归纳为三大类，其一是以活的病毒或细菌通...