鸡神经肽Y（NPY）基因在毕赤酵母中的表达

为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。     

来航鸡FOXL2基因的真核表达及纯化

【目的】对来航鸡FOXL2基因进行真核表达及纯化,为其生物学功能研究奠定基础。【方法】根据GenBank已发表的来航鸡FOXL2基因序列(GenBank登录号:JF_708868.1)设计引物,以来航鸡全血DNA为模板,PCR扩增FOXL2基因,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后定向克隆于pPICZαA中,获得pPICZαA-FOXL2真核表达载体。将pPICZαA-FOXL2转化毕赤酵母菌GS115,用甲醇进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测。【结果】克隆了918bp的FOXL2基因;成功构建了pPICZαA-FOXL2真核表达载体;实现了FOXL2基因在毕赤酵母菌GS115中的融合表达,获得了分子质量约为37ku的重组蛋白FOXL2,经Western blotting检测其具有较好的生物学活性。【结论】成功地在毕赤酵母中表达了来航鸡FOXL2基因。     

巴斯德毕赤酵母多拷贝整合表达组装禽流感病毒样颗粒

【目的】构建多拷贝整合表达禽流感病毒样颗粒的重组巴斯德毕赤酵母,为H5N1亚型禽流感基因工程疫苗提供基础。【方法】以巴斯德毕赤酵母GS115株18S rRNA基因(rDNA)部分序列,插入pPIC9K载体上XbaⅠ和Bsp1407Ⅰ位点间,构建多拷贝整合表达质粒p8K。再以禽流感病毒H5N1毒株基因组RNA为模板,RT-PCR扩增HA、M和NA基因,分别插入多拷贝载体p8K,构建表达质粒 p8K-HA/M/NA。表达质粒分别扩增后线性化,按比例混合,电转化GS115感受态细胞。增菌后,经遗传霉素G418抗性平板筛选、PCR鉴定携带HA、M和NA基因序列的多拷贝整合菌株。阳性菌株增菌、诱导表达、高压均质破碎后,Western-blot检测表达产物。【结果】PCR鉴定阳性的重组菌株,其细胞裂解蛋白,免疫印迹试验可检测到与HA、M₁和NA分子量一致的蛋白条带;电子显微镜可观察到大小约为80~120 nm 的病毒样颗粒,免疫鸡能产生抗禽流感病毒中和抗体。【结论】重组毕赤酵母能够多拷贝整合、表达、组装禽流感病毒样颗粒。     

鸡PLAM2基因的克隆与原核表达及PLA2蛋白卵黄抗体的制备

【目的】克隆并原核表达鸡PLA2基因,小量制备鸡PLA2卵黄抗体,为大规模制备PLA2卵黄抗体作为饲料添加剂提供参考。【方法】提取鸡胰脏总RNA,利用RT-PCR方法获得鸡PLA2基因,将其克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中,构建表达载体pGEX-4T-1-PLA2,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-PLA2融合蛋白。将GST-PLA2融合蛋白免疫青年蛋鸡,每次0.3mg/只,共免疫4次,收集鸡蛋,提取卵黄抗体,采用West-ern Blotting检测抗体的特异性。【结果】成功克隆出了鸡PLA2基因,构建了pGEX-4T-1-PLA2原核表达载体,并诱导表达了分子质量为44.59ku的GST-PLA2融合蛋白。GST-PLA2融合蛋白免疫蛋鸡后获得了卵黄抗体,经West-ern Blotting检查,制备的卵黄抗体具有很好的特异性。【结论】构建了表达鸡PLA2基因的表达系统,并成功的制备了抗鸡PLA2的卵黄抗体。     

转H5禽流感病毒M2e基因烟草的研究

将禽流感病毒M2e与鸡IgG Fc的融合基因转入烟草植株,利用烟草生产禽流感抗原蛋白,探索利用植物作为生物反应器生产禽流感疫苗的可行性。将M2e-Fc融合基因克隆到植物表达载体pBI121中,与CaMV35s启动子相连,以烟草子叶作为外植体,利用农杆菌介导法将外源基因转入烟草中。对抗性植株进行了PCR、RT-PCR分析。结果表明,M2e基因已经导入到烟草中,在转录水平得到了表达。为进一步利用转基因植物生产禽流感疫苗进行了前期的探索工作。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的原核与真核表达

【目的】构建H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因的原核和真核表达载体,将其分别在大肠杆菌和293细胞中进行表达,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与宿主的相互作用,以及鉴定禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽ELISA诊断试剂盒的制备提供理论依据。【方法】用RT-PCR方法扩增H9N2亚型AIV的NS1基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建NS1基因的原核重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;同时,将NS1基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建NS1基因真核重组质粒,将其瞬时转染293细胞,48h后收集感染细胞,对大肠杆菌表达产物和293细胞表达产物进行Western-blotting分析。【结果】成功构建了NS1基因的原核表达载体pET-32a-NS1和真核表达载体pEGFP-C1-NS1。Western-blotting结果表明,大肠杆菌和293细胞的表达产物均能检测到特异性条带(大肠杆菌的表达产物在约44ku处出现阳性条带,293细胞表达产物在约55ku处出现特异条带)。【结论】NS1基因在大肠杆菌和293细胞中得到成功表达,获得的NS1蛋白具有良好的抗原活性。     

柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E基因的表达及其产物的生物活性分析

【目的】探讨原核表达的柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E蛋白的生物学活性。【方法】将含有3-1E基因的pGEX-3-1E重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行表达并对表达条件进行优化,表达产物纯化后进行Western-blot-ting分析。【结果】表达的3-1E重组蛋白相对分子质量为44.7 ku,与推导结果一致。在28℃、IPTG诱导浓度为0.5mmol/L的条件下诱导6 h,可溶性3-1E重组蛋白表达量最高。Western-blotting结果表明,3-1E重组蛋白可与兔抗鸡E.tenellaYL阳性血清发生反应。【结论】3-1E重组蛋白表达成功,表达产物具有免疫原性。     

猪瘟流行毒株E2基因主要抗原区的原核高效表达

【目的】构建猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)E2基因主要抗原区原核表达质粒载体,高效表达E2蛋白,为进一步研究E2亚单位疫苗提供物质基础。【方法】用RT-nested PCR技术扩增CSFV流行毒株SX-YL株E2基因主要抗原区,克隆于表达载体pET32a中,成功构建表达质粒pET32a-E2,将pET32a-E2转入BL21(DE3)受体菌并用IPTG诱导表达E2蛋白,对E2蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析和可溶性鉴定。【结果】CSFVE2基因得到了高效表达,表达蛋白量占菌体蛋白量的33.2%,表达蛋白E2主要以包涵体形式存在;免疫印迹分析结果表明,表达蛋白E2能识别天然猪瘟多克隆抗体。【结论】E2蛋白表达量高并具有生物学活性。     

丹毒丝菌SpaA基因免疫保护区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.【方法】以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因c DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到Spa A-N,并将其连接到表达载体p PICZαC上,得到重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N;用Sac I酶将重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YPDS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.【结果和结论】成功克隆并表达了Spa A-N基因,构建了重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌Spa A-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.     

鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探

为了研究鸡α干扰素(ChIFNα)基因的特性和功能,将鸡α干扰素的DNA序列克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株,用PCR技术鉴定阳性转化子。重组菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇诱导后,分泌表达重组蛋白,斑点杂交(dot-blot)检测IFNα具有免疫原性。细胞病变抑制法表明,表达产物有明显的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒活性。     

效应蛋白OhEF 2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性

白粉菌通过在植物细胞内形成吸器,产生大量的效应蛋白,从而实现在寄主细胞内的侵染。前期有研究人员对Oidium heveae进行基因组和转录组测序分析,预测出133个潜在的效应蛋白。笔者克隆了其中的一个基因OhEP2 (Oidium heveae Effector Protein 2),并构建了OhEF 2基因在拟南芥Col-0背景下的过表达转基因植株。通过接种发现,过量表达OhEF 2可以明显促进拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性,但不能提高假单胞菌DC 3000的毒性功能,表明OhEF 2可能只在白粉菌侵染的过程中发挥作用。进一步研究发现,OhEF 2显著降低了橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的胼胝体沉积和PR1 (Pathogen-Related Gene1)基因表达,这为进一步研究效应蛋白OhEF 2在植物体内的毒性作用机理奠定了基础。     

苹果类泛素蛋白MdRAD23C2基因的分离及功能鉴定

【目的】研究苹果类泛素蛋白RAD23基因（MdRAD23C2）的功能,为抗旱苹果新品种的培育奠定基础。【方法】以秦冠苹果(Malus domestica cv.‘Qinguan’)为材料,克隆MdRAD23C2基因,对其进行生物信息学和定位分析,通过实时定量PCR分析其在不同逆境胁迫下（干旱、盐、碱和ABA）的表达模式。构建过表达载体转化农杆菌,采用叶盘法转化烟草,选取相应的转基因烟草株系,分析干旱胁迫下转基因烟草的相对电导率和丙二醛、叶绿素、过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O^-·₂）含量以及二氨基联苯胺(DAB)、氮蓝四唑(NBT)染色情况,探讨MdRAD23C2过表达对转基因烟草抗旱能力的影响。【结果】苹果_MdRAD23C2基因编码序列长1 146 bp,编码381个氨基酸,其定位于细胞核和细胞膜中,可响应干旱、盐和碱等逆境胁迫。干旱处理2周,野生型烟草株系萎蔫程度明显,且DAB和NBT染色加深,相对电导率、丙二醛、H₂O₂和O^-·₂含量均极显著高于转基因型烟草,而叶绿素含量极显著低于转基因型烟草,说明过量表达MdRAD23C2的烟草株系对干旱胁迫的耐受性明显增强。【结论】分离克隆了苹果MdRAD23C2基因,该基因可提高转基因植物对干旱胁迫的耐受性。     

三角帆蚌IGF2基因的亚细胞定位及重组蛋白促体外细胞活性分析

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factors 2, IGF2)在多种细胞生长、分化和合成代谢的调节中发挥重要的调控作用。本研究成功构建了淡水珍珠贝三角帆蚌IGF2的重组质粒pEGFP-IGF2和pET32a-IGF2,通过pEGFP-IGF2-细胞转染,表明该蛋白定位在细胞质与细胞核中。将pET32a-IGF2转化到BL21 (DE3)中进行蛋白诱导表达,成功得到其原核表达载体,SDS-PAGE检测显示,在约25kD处有一条清晰的条带,符合目的条带大小（26.27kD）,且主要表达于上清液中。为研究重组蛋白IGF2对三角帆蚌细胞活性的作用,本研究通过CCK8细胞活性测定,进一步探讨了添加不同浓度重组目的蛋白（0 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL、 12.5 μg/mL、17.5 μg/mL、 22.5 μg/mL）培养的三角帆蚌外套膜细胞增殖活性。结果显示,三角帆蚌IGF2重组蛋白能显著促进三角帆蚌外套膜细胞的增殖活力（P＜0.05）,且在其浓度为12.5 μg/mL时对三角帆蚌外套膜细胞的促生长效果最佳,这为促进三角帆蚌外套膜细胞传代、细胞系建立奠定了基础,也为下一步探究IGF2在贝类中的功能提供依据。     

花生油酸脱氢酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的时空表达特征

花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。     

东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的 生物信息学分析

旨在解析东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）基因STPK的理化性质和分子特性，并对东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫的STPK进行结构域和保守基序预测及系统进化分析，以期丰富东方蜜蜂微孢子虫的STPK信息，并为深入开展STPK的功能研究提供基础。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析STPK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种STPK的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的STPK进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建基于STPK的系统进化树。结果显示：东方蜜蜂微孢子虫STPK基因含2 595个核苷酸，编码的STPK蛋白含864氨基酸。分子量约为101.08 kDa，分子式为C₄₅₂₈H₇₁₅₀N₁₁₆₂O₁₃₇₉S₃₆，脂溶系数为88.48，等电点为5.47；STPK包含40个丝氨酸磷酸化位点，24个酪氨酸磷酸化位点及23个苏氨酸磷酸化位点。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫及柑橘凤蝶（Papilio xuthus）的STPK均含有2个相同的结构域（PK_Tyr_Ser_Thr和Pkinase）与5个相同的保守基序（Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif 4和Motif 5）。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫的STPK序列一致性介于38.14%~61.06%，东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微粒子虫的STPK序列一致性最高（61.06%）。东方蜜蜂微孢子虫STPK（AAJ76_500008712）与颗粒病微粒子虫（Nosema granulosis）STPK（KAF9763807.1）聚为一支，微孢子虫属（KAH9412228.1）、脑炎微孢子虫（KAG5858968.1）和兔脑炎微孢子虫（ECU01_1320）的STPK聚为一支，康氏泰罗汉孢虫（KAF7683612.1）和蝗虫微孢子虫（AAT12343.1）聚为一支。研究结果明确了STPK的理化性质和分子特性，揭示东方蜜蜂微孢子虫和上述其他9种微孢子虫的STPK具有较高的保守性。     

东南景天捕光叶绿素a/b结合蛋白基因SaLhcb2的分离及功能

LHCB基因对植物适应各种环境胁迫的过程中起着重要作用。序列分析显示:东南景天Sedum alfredii的SaLhcb2基因全长929 bp, 其中开放阅读框(ORF)为798 bp, 含有1个74 bp的内含子。通过蛋白序列比对, SaLhcb2基因编码的蛋白与多种植物的蛋白序列同源性都很高(92%以上)。分析400 μmol·L-1镉离子(Cd2+), 铜离子(Cu2+)和铅离子(Pb2+)胁迫处理后的东南景天, 结果显示:镉处理后SaLhcb2基因在茎、叶中表达量快速上升(12.0 h内), 根中表达量到48.0 h后才上调。铜处理后0.5 h根中表达显著上调, 胁迫6.0 h后茎中表达量显著上调, 随后一直降低, 叶片中该基因表达量一直较低。铅处理后, 根中表达量降低, 96.0 h左右比对照略微上调, 而茎中96.0 h内表达量相比对照都上调, 叶片中96.0 h内都降低。研究结果表明:SaLhcb2与东南景天的镉、铜、铅胁迫抗性有密切的相关性。     

绵羊繁殖轴相关组织TPH1和TPH2基因表达分析及TPH2基因多态性与产羔数的关系

为探讨TPH1和TPH2基因在绵羊不同繁殖状态下的表达差异及TPH2基因多态性与小尾寒羊产羔数的关系,利用实时荧光定量PCR技术检测该2个基因在不同繁殖状态下成年苏尼特羊(短光照3只,长光照3只)和小尾寒羊(卵泡期3只,黄体期3只)的大脑、小脑、下丘脑、松果体、垂体、卵巢、输卵管、子宫、肾脏和肾上腺等10种组织中的相对表达量;同时采用Sequenom MassARRAY?SNP技术检测TPH2基因单核苷酸多态位点SNP在常年发情绵羊品种(小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊)和季节性发情绵羊品种(滩羊、苏尼特羊和草原型藏羊)的多态性,并将基因多态性与小尾寒羊产羔数进行关联分析。结果表明:该2个基因在2个绵羊品种各组织广泛表达,TPH1基因在苏尼特羊下丘脑和松果体中短光照表达量极显著高于长光照(P0.01),在苏尼特羊垂体中短光照表达量显著高于长光照(P0.05),在小尾寒羊垂体和卵巢中卵泡期显著低于黄体期(P0.05);TPH2基因在苏尼特羊卵巢组织长光照下的表达量显著高于短光照(P0.05),TPH2基因在小尾寒羊下丘脑组织中卵泡期的表达量极显著高于黄体期(P0.01)。小尾寒羊中TPH2基因g.107854166CT和g.1078541669CT 2个SNP位点关联分析表明,该2个位点与季节性发情性状和小尾寒羊第1、2以及第3胎产羔数均无显著关联(P0.05)。综上,TPH1和TPH2基因在苏尼特羊绵羊下丘脑和松果体中呈季节性光照节律差异表达,暗示其可能参与季节性发情上游基因的调控,而TPH2基因可能参与调控小尾寒羊下丘脑中激素分泌和卵巢发育,但g.107854166CT和g.1078541669CT不是调控季节性发情和小尾寒羊产羔数的关键位点。     

杜鹃叶片3种蛋白质提取方法的比较

以映山红(R.simsii)、马银花(R.ovatum)、满山红(R.mariesii)和云锦杜鹃(R.fortunei)4种杜鹃为实验材料,采用TCA-丙酮法、酚法和TCA-丙酮-酚法3种蛋白质提取方法提取杜鹃叶片蛋白质,并应用双向电泳技术(2-DE)比较分析不同方法的蛋白质提取率、溶解性、完整性等的差异,确立适用于2-DE分析的杜鹃叶片蛋白质提取方法。结果表明,TCA-丙酮法提取的蛋白溶解性差且粘稠,得到的蛋白质点少,不适合杜鹃叶片蛋白的提取;酚法提得的蛋白质溶解性好,蛋白质点多,但是杂质较多,且此法不适用于映山红叶片蛋白的提取;TCA-丙酮-酚法提取的杜鹃叶片蛋白质位点较多且清晰,重复性也好,且4种杜鹃叶片蛋白的提取效果都比较好。因此,TCA-丙酮-酚法被认为最适于杜鹃属植物叶片蛋白质的提取及分析。     

金鱼Dmrt2基因表达分析

采用荧光定量PCR技术检测了Dmrt2基因的两个亚型Dmrt2a和Dmrt2b在金鱼(Carassius auratus)不同发育时期以及不同组织中的表达情况,用RACE技术克隆得到金鱼Dmrt2a cDNA序列的全长为1 755 bp,5’和3’非编码区长分别为188 bp和67 bp,推测的开放阅读框可编码499个氨基酸的多肽。分子系统进化分析表明金鱼Dmrt2a与其它鱼类Dmrt2a基因聚成一支,与斑马鱼(Daniorerio)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、青鳉(Oryzias latipes)、罗非鱼(Oreochromis Niloticus)Dmrt2a的同源性分别为85%、61%、58%、58%。荧光定量PCR结果揭示,Dmrt2a在精巢中表达量最高,在卵巢中次之,而Dmrt2b在卵巢中表达量最高,在精巢中次之,二者在肾脏、消化道、肝脏、心脏和脑中都有表达,但表达量低;不同发育时期胚胎和仔鱼的Dmrt2a和Dmrt2b表达量变化很大,Dmrt2a在受精后24 h达到最高值,之后表达量降低,而Dmrt2b在孵化后仔鱼中表达量显著增加。     

关于不定方程5x(x+1)(x+2)(x+3)=18y(y+1)(y+2)(y+3)

运用Pell方程、递推序列、同余式及平方剩余等初等数论知识,证明了不定方程5x(x+1)(x+2)(x+3)=18y(y+1)(y+2)(y+3)仅有4组非平凡整数解(x,y)=(6, 4),(-9, 4),(6,-7),(-9,-7),同时给出该不定方程的全部整数解,分别为(x,y)=(0, 0),(0,-1),(0,-2),(0,-3),(-1, 0),(-1,-1),(-1,-2),(-1,-3),(-2, 0),(-2,-1),(-2,-2),(-2,-3),(-3, 0),(-3,-1),(-3,-2),(-3,-3),(6, 4),(-9, 4),(6,-7),(-9,-7).