鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探

为了研究鸡α干扰素(ChIFNα)基因的特性和功能,将鸡α干扰素的DNA序列克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株,用PCR技术鉴定阳性转化子。重组菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇诱导后,分泌表达重组蛋白,斑点杂交(dot-blot)检测IFNα具有免疫原性。细胞病变抑制法表明,表达产物有明显的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒活性。     

影响A型流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白研究

 【目的】流感病毒样颗粒在病毒学研究和新型疫苗开发方面发挥着巨大作用。本研究旨在建立一种简便的包装病毒样颗粒的方法来阐明影响流感病毒样颗粒包装及释放的关键结构蛋白。【方法】构建同时表达HA、NA和M1 3个蛋白,同时表达HA和NA两个蛋白以及只表达HA蛋白的真核表达质粒,然后转染293 T细胞,检测细胞培养上清血凝效价初步判断是否包装并释放出病毒样颗粒,并采用透射电子显微镜观察病毒样颗粒的形态。【结果】表达HA和NA或表达HA、NA和M1蛋白的真核表达质粒转染293 T细胞后,检测细胞上清血凝价均为24 ;而转染单独表达HA蛋白质粒的细胞上清没有血凝活性。电镜观察表明单独表达HA蛋白没有可见的病毒样颗粒,而表达上述两个或3个蛋白均可观察到病毒样颗粒。【结论】本研究采用同时表达多个结构蛋白的真核表达载体来研究病毒样颗粒包装及释放的必须蛋白,研究结果表明M1在病毒样颗粒包装及释放过程中是非必须蛋白,而NA和HA蛋白是影响流感病毒样颗粒形成及释放的关键蛋白。     

His标签的水稻硅转运蛋白表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1).     

禽流感病毒M2e基因与鸡IgG Fc基因在巴斯德毕赤酵母中的融合表达

【目的】得到融合蛋白M2e-Fc,并检测其免疫学特性,为研制禽流感通用疫苗奠定基础。【方法】根据禽流感病毒H5N1的M2e蛋白氨基酸序列设计2条长互补引物,通过重叠区互补扩增基因法扩增出目的基因M2e,然后与鸡IgGFc片段基因一起克隆入毕赤酵母表达质粒中,构建酵母表达载体。将阳性质粒线性化后电转化入感受态毕赤酵母X-33中,再经甲醇诱导后,通过Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定融合蛋白。之后用其免疫非免疫鸡,检验其免疫原性。【结果】成功构建了表达M2e和Fc融合蛋白的酵母表达载体pPICZαA-M2-Fc,并通过Zeocin筛选及PCR鉴定出了阳性重组子;阳性重组子经甲醇诱导后得到融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定证实,融合蛋白得到正确表达,并且可以与M2e阳性血清反应。动物免疫试验证实,该融合蛋白可以诱导鸡产生抗M2e抗体,具有良好的免疫原性。【结论】融合蛋白M2e-Fc在巴斯德毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,该融合蛋白具有较好的免疫原性,为后期进行其他免疫试验奠定了基础。     

重组水貂生长激素真核表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

【目的】构建水貂生长激素（mGH）基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得水貂生长激素奠定基础。【方法】将体外合成的水貂生长激素基因插入分泌型表达载体pPIC9K。将重组的pPIC9K-mGH用SacI酶切后,LiC1法转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blot检测酵母上清中水貂生长激素的表达。【结果】酵母上清中可见与目的蛋白相对分子量（31kd）相符的条带,该条带可被水貂生长激素多克隆抗体特异识别。【结论】正确构建了水貂生长激素真核表达载体,该蛋白能在巴斯德毕赤酵母中成功表达。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因在毕赤酵母中表达

将番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC蛋白基因与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9Kσ-C,转化大肠杆菌DH5α,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9Kσ-C用内切酶SacⅠ线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合,采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了高效表达,并且具有免疫反应性。     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆载体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用Sal I线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31kD的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中组成型表达及其抑菌活性检测

为获得具有生物活性作用的猪乳铁蛋白肽LFcinP基因在巴斯德毕赤酵母中进行组成型表达,检索NCBI数据库公布的牛、羊、猪、骆驼等动物的乳铁蛋白及其抗菌肽的氨基酸序列,运用ExPASY在线网站,对猪乳铁蛋白保守区域所编码的蛋白进行理化性质分析,参照巴斯德毕赤酵母使用密码子偏好性,优化设计合成138 bp编码猪乳铁蛋白肽LFcinP基因,通过pGAPHαM酵母组成型分泌表达载体将其整合到巴斯德毕赤酵母GS115菌株,获得表达猪乳铁蛋白肽LFcinP基因重组酵母菌株GS115p/GAPHαM-LFcinP。SDS-PAGE和Westernblot分析表明,获得5.4 ku乳铁蛋白肽;分析96 h的蛋白电泳带结果表明,重组蛋白占酵母菌上清蛋白35.9%,表达量为48.5μg.mL-1;动态生长曲线法抑菌试验结果表明,重组猪乳铁蛋白肽具有一定的抑菌作用。     

水稻膨胀素基因OsEXP2在毕赤酵母中的表达

膨胀素是一类可以诱导失活细胞壁伸展的蛋白质,试验通过克隆水稻膨胀素(OsEXP2)基因并在巴斯德毕赤酵母中表达,以研究其对纤维素的作用。根据已知序列设计引物,经RT-PCR克隆OsEXP2基因,并插入毕赤酵母表达载体pGAPHα中,位于α-信号肽下游,得到重组质粒pGAPHα-OsEXP2。将其线性化后通过电转化,转化毕赤酵母菌株GS115,OsEXP2基因通过同源重组整合到毕赤酵母的基因组上,得到重组菌株GS115/pGAPHα-O-sEXP2。该菌株发酵液可使滤纸发生崩解现象,并使纤维素酶滤纸酶活性(Filter Paper Enzyme Activity,FPA)提高了47.87%。     

鸡γ干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达

为了获得高效分泌表达ChIFNγ的重组毕赤酵母菌株,利用基因工程技术,将435 bp的ChIFNγ成熟肽编码基因亚克隆到巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达载体PPICZαC中,将该重组质粒用BstX Ⅰ线性化并通过电击法转化毕赤酵母X-33菌株,用500 μ/mL抗生素Zeocin筛选高拷贝阳性重组菌.甲醇诱导表达的重组ChIFNγ经SDS-PAGE电泳,可在相对分子质量约2.0×104处检测到目的蛋白带,目的蛋白占酵母表达上清液总蛋白质的35％.微量细胞病变抑制法检测表达产物的生物学活性,检测结果表明,巴斯德毕赤酵母表达的重组ChIFNγ的抗病毒效价为6 400 U/mL.     

家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母GS115中的表达及其分析

【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶（BmAChE）的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE（rBmAChE）的生物活性。【结果】改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1 187 U•mg-1。抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50值可达2.78×10-10 mol•L-1。【结论】成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。     

毕赤酵母表达MSL的发酵条件研究

本试验对含有pPIC9K-MSL转化子的毕赤酵母在BSM基础盐培养基中发酵培养条件进行了研究,并从BSM基础盐培养基组分、补料方式以及诱导时间对酵母生长发酵和表达高浓度的外源蛋白的影响进行了单因素优化试验,得到了毕赤酵母在BSM基础盐中发酵MSL的生产工艺。     

东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的表达、纯化及抑菌活性分析

  【目的】利用毕赤酵母菌真核表达系统重组表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST,分析评价dybowskin-1ST的抑菌活性。【方法】采用TRIzol法提取蛙皮总RNA,经RT-PCR扩增获得抗菌肽dybowskin-1ST基因,将目的基因克隆到毕赤酵母菌分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-1ST。经电转化将pPIC9K-1ST转入到毕赤酵母菌GS115中,获得高效表达dybowskin-1ST的重组菌株。以甲醇诱导重组菌株,上清液经SDS-PAGE检测表明有目的蛋白dybowskin-1ST分泌表达。目的蛋白经Ni-agarose色谱柱分离纯化后,对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肠炎沙门氏菌和蜡状芽孢杆菌进行抑菌活性分析。【结果】成功构建了东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的毕赤酵母真核表达系统,且dybowskin-1ST对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抑菌效果。【结论】东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST具有良好的广谱抗菌活性和潜在的研发价值。     

植物防御素基因alfAFP(M. sativa)在毕赤酵母中的分泌表达及对水稻病原菌的抑制

 【目的】大多数的植物防御素对不同的病原菌具有抗菌活性,其中来自苜蓿种子的防御素alfAFP的转基因土豆和番茄已经被证明对病原菌具有强抗病性。进一步研究该基因对稻瘟病、纹枯病、白叶枯病三大重要病害的抑制作用,对水稻抗病基因工程研究具有重要的意义。【方法】本试验将alfAFP构建到表达载体pPIC9K上,电转化毕赤酵母（GS115）,再进行蛋白质的分泌性诱导表达,最后进行体外重组蛋白对水稻病菌的抑菌活性检测。【结果】通过15%的SDS-PAGE检测,得到大约6.5 kD的重组蛋白。alfAFP融合蛋白对水稻纹枯病、稻瘟病和白叶枯病均具有一定的抑制活性,其中对纹枯病的作用最为明显。【结论】alfAFP在酵母中成功诱导表达,并对水稻测试病菌具有一定的抑制活性,预示着alfAFP防御素基因在水稻抗病基因工程中具有潜在的应用价值。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母GS115中的表达

以微小毛霉基因组为模板,PCR扩增得到凝乳酶结构基因,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后,连接穿梭载体pPIC9K,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并测定其核苷酸序列。测序结果证实扩增得到的片段为凝乳酶基因,与GenBank报道的序列（No.X06219）存在6对碱基的区别。将重组质粒电转化毕赤酵母GS115,构建重组菌P.pastorisGS115/pPIC9K-m cp,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/m l、具有多拷贝基因的整合重组菌pPIC9K-m cp-03。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得该重组菌凝乳酶活力为5 660 U/m l,比微小毛霉发酵液提高50多倍,且发酵液电泳结果表明毕赤酵母自身分泌的蛋白很少,只能看到约38.5 ku的凝乳酶蛋白条带。     

铜绿假单胞菌algL基因在毕赤酵母中的表达及其性质研究

 【目的】通过构建毕赤酵母工程菌株,以期获得重组海藻酸裂解酶,并对其性质加以研究。【方法】采用PCR的方法,以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因组DNA 为模板,克隆出约1.0kb的海藻酸裂解酶基因algL的成熟蛋白编码序列,并将其插入巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC9K-algL。重组质粒线性化后用聚乙二醇（PEG）法导入毕赤酵母菌株GS115中表达。【结果】用甲醇诱导培养基进行摇瓶发酵,表达得到40 kD的目的蛋白,酶活力达540 U•ml-1左右。经测定,该重组酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为40℃,并且在20～45℃,pH 3.0～12.0具有较好的稳定性。50 mmol•L-1的Co2+和Ca2+对酶活力均有显著的促进作用,Zn2+、Cu2+和Fe2+在不同浓度下对酶活力均有不同程度的抑制作用。在重组酶的辅助作用下,抗生素的抑菌效果明显提高。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源海藻酸裂解酶,为其今后在工农业中的应用奠定了基础。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。     

黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究

应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。