中华蜜蜂酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶相关基因 及其全长转录本发掘与分析

为深入开展中华蜜蜂相关研究提供参考信息和基础,利用已获得的纳米孔(Nanopore)测序数据对中华蜜蜂Apis cerana cerana的酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)相关基因和全长转录本进行发掘和分析。通过Blast工具将中华蜜蜂所有全长转录本比对KEGG和Nr数据库以筛选出PO和SP相关基因和全长转录本。采用gffcompare软件将PO和SP相关全长转录本与东方蜜蜂参考基因组(ACSNU-2. 0)已注释基因进行比较以优化结构。使用Astalavista软件鉴定PO和SP相关基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件,再利用IGV浏览器进行结构可视化。通过PCR验证AS事件的真实性。利用TAPIS pipeline预测和分析可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)位点,并通过TBtool软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因与146条转录本。优化了16个参考基因组已注释PO和SP相关基因的结构,其中5′端延长和3′端延长的基因均有7个,5′端和3′端同时延长的基因有2个。鉴定到PO和SP相关的10个基因的389次AS事件,其中最丰富的AS类型是5′端可变剪接。PCR结果证实了2次AS事件的真实性。共鉴定到34个PO和SP相关基因含有1个及以上的APA位点,其中含有3个APA位点的基因数量最多;在APA位点上游鉴定到多个motif,一致性序列为：GGHKSYWSHHTRATWTCNBHDMRRYWYRTNYTVACNGCKGCDCAYTGYR。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因和146条全长转录本,优化了东方蜜蜂参考基因组已注释的PO和SP相关基因结构,并发掘出PO和SP相关基因的389次AS事件和237个APA位点。     

意大利蜜蜂AmMETTL3基因的分子克隆与表达模式

为克隆意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）的AmMETTL3基因,解析AmMETTL3蛋白的分子特性,并测定AmMETTL3在工蜂不同组织及发育时期的表达谱。通过PCR扩增AmMETTL3的CDS并进行Sanger测序验证;使用相关生物信息学软件预测AmMETTL3的理化性质和分子特性,鉴定METTL3的结构域和保守基序,并构建系统进化树;采用RT-qPCR检测AmMETTL3在工蜂7个组织及5个不同发育时期的相对表达量。结果表明：成功克隆到AmMETTL3的CDS并发现AmMETTL3不含典型的跨膜结构域和信号肽;METTL3在各种昆虫中高度保守且含1个MT-A70结构域和3个相同的保守基序;AmMETTL3与东方蜜蜂METTL3的亲缘关系最近;相较于触角中的表达量,AmMETTL3的表达量在咽下腺中极显著上调（P<0.01）,在中肠中极显著下调（P<0.01）;AmMETTL3在3日龄幼虫中的表达量极显著（P<0.01）低于卵中的表达量,在12日龄蛹中的表达量极显著（P<0.01）高于卵中的表达量,在2、6、12、15和18日龄工蜂体内的表达量极显著（P<0.01）低于1日龄工蜂体内的表达量。研究结果为深入探究AmMETTL3的功能及其参与的表观调控机制提供了参考和依据。     

东方蜜蜂微孢子虫染色体结构维持(SMC)蛋白的分子特性与系统进化分析

目的 解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae染色体结构维持(Structural maintenance of chromosome，SMC)蛋白的分子特性，鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的SMC的保守基序和结构域，并进行系统进化分析，旨在丰富东方蜜蜂微孢子虫SMC的基本信息，为功能研究的深入开展提供依据。方法 使用Expasy网站的相关软件预测和分析SMC的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构，利用MEME软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种SMC的保守基序，采用TBtools软件鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种SMC的结构域，通过Mega 11.0软件采用邻接法构建东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的SMC系统进化树。结果 东方蜜蜂微孢子虫SMC包含1 102个氨基酸，分子式为C₅₇₈₇H₉₄₁₈N₁₅₂₆O₁₇₇₁S₄₁，相对分子质量约130 020，脂溶系数为93.49，等电点为8.28，平均亲水系数为−0.740，亲水氨基酸多于疏水氨基酸，不含典型信号肽；包含50个丝氨酸磷酸化位点、26个酪氨酸磷酸化位点及28个苏氨酸磷酸化位点；包含787个α−螺旋、106条β−折叠、49个β−转角及160个无规则卷曲；可同时定位于细胞核、细胞质和线粒体。在东方蜜蜂微孢子虫、海伦脑炎微孢子虫Encephalitozoon hellem、麦格水蚤汉氏孢虫Hamiltosporidium magnivora、颗粒病微孢子虫Nosema granulosis、康氏泰罗汉孢虫Thelohania contejeani、菲尼斯毕罗酵母Piromyces finnis、指间毛廯菌Trichophyton interdigitale、紫色毛廯菌Trichophyton violaceum、发廯菌Trichophyton tonsurans和黑曲霉Aspergillus melleus 的SMC中预测到相同的9个保守基序；东方蜜蜂微孢子虫和上述其他9个物种的SMC中均含有1个SMC_N结构域和1个SMC_hinge结构域。进一步分析发现，东方蜜蜂微孢子虫与菲尼斯毕罗酵母的SMC序列相似性最高(61.96%)，与康氏泰罗汉孢虫的SMC序列相似性最低(34.73%)；东方蜜蜂微孢子虫与颗粒病微孢子虫的SMC聚为一支，置信度达到99%，进化距离最近。结论 本研究明确了东方蜜蜂微孢子虫SMC的分子特性，丰富了SMC的基本信息，并揭示SMC在东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫中具有较高的保守性，为功能研究的深入开展提供了依据。     

东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的 生物信息学分析

旨在解析东方蜜蜂微孢子虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）基因STPK的理化性质和分子特性，并对东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫的STPK进行结构域和保守基序预测及系统进化分析，以期丰富东方蜜蜂微孢子虫的STPK信息，并为深入开展STPK的功能研究提供基础。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析STPK的理化性质、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。使用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种STPK的保守基序。通过Mega 11.0软件对东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的STPK进行氨基酸序列多重比对，并采用邻接法构建基于STPK的系统进化树。结果显示：东方蜜蜂微孢子虫STPK基因含2 595个核苷酸，编码的STPK蛋白含864氨基酸。分子量约为101.08 kDa，分子式为C₄₅₂₈H₇₁₅₀N₁₁₆₂O₁₃₇₉S₃₆，脂溶系数为88.48，等电点为5.47；STPK包含40个丝氨酸磷酸化位点，24个酪氨酸磷酸化位点及23个苏氨酸磷酸化位点。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫及柑橘凤蝶（Papilio xuthus）的STPK均含有2个相同的结构域（PK_Tyr_Ser_Thr和Pkinase）与5个相同的保守基序（Motif 1, Motif 2, Motif 3, Motif 4和Motif 5）。东方蜜蜂微孢子虫与其他9个微孢子虫的STPK序列一致性介于38.14%~61.06%，东方蜜蜂微孢子虫和蜜蜂微粒子虫的STPK序列一致性最高（61.06%）。东方蜜蜂微孢子虫STPK（AAJ76_500008712）与颗粒病微粒子虫（Nosema granulosis）STPK（KAF9763807.1）聚为一支，微孢子虫属（KAH9412228.1）、脑炎微孢子虫（KAG5858968.1）和兔脑炎微孢子虫（ECU01_1320）的STPK聚为一支，康氏泰罗汉孢虫（KAF7683612.1）和蝗虫微孢子虫（AAT12343.1）聚为一支。研究结果明确了STPK的理化性质和分子特性，揭示东方蜜蜂微孢子虫和上述其他9种微孢子虫的STPK具有较高的保守性。     

东方蜜蜂微孢子虫20s PS基因的分子克隆与生物信息学分析

为解析东方蜜蜂微孢子虫Nosema ceranae的20s 蛋白酶体亚基（20s proteinsome submit, 20s PS）基因20s PS的分子特性，鉴定东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的20s PS蛋白的保守基序和结构域并进行系统进化分析，通过常规PCR扩增20s PS的CDS区并进行TA克隆。通过Expasy网站上的相关软件预测和分析20s PS的理化性质、跨膜螺旋域、信号肽、磷酸化位点、二级结构和三级结构。采用MEME软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种20s PS的保守基序。利用TBtools软件预测东方蜜蜂微孢子虫和其他物种20s PS的结构域。使用Mega 11.0软件构建东方蜜蜂微孢子虫和其他物种的20s PS的系统进化树。成功克隆到东方蜜蜂微孢子虫20s PS的CDS区，20s PS在孢子中真实表达。20s PS基因含有618个核苷酸，可编码205个氨基酸；20s PS蛋白的分子式为C₁₀₂₂H₁₅₈₂N₂₆₀O₃₁₆S₁₂，分子量约为22.95 kDa，脂溶系数为78.93，等电点为5.00，平均亲水系数为-0.157；不含跨膜螺旋域和典型信号肽；包含14个丝氨酸酸化位点，5个络氨酸酸化位点及6个苏氨酸磷酸化位点；包含73个α-螺旋，46个延长链，21个β-转角和65个无规-则卷曲；可同时定位于细胞质、细胞核和线粒体；与模板5mp9.1.J之间的同源性为37.75%。东方蜜蜂微孢子虫、蚱蜢脑炎微孢子虫Encephalitozoon romaleae和肠脑炎微胞子虫Encephalitozoon intestinalis等7个物种的20s PS中均含有5个相同的保守基序（motif1, motif2, motif3, motif4和motif5）。东方蜜蜂微孢子虫、蜜蜂微孢子虫Nosema apis、杀线虫sp Nematocida sp、泛孢虫Pancytospora philotis和毕氏肠微孢子虫Pancytospora philotis的20s PS中均包含Ntn_hydrolase superfamily结构域。东方蜜蜂微孢子虫20s PS（XP_024330780.1）与蜜蜂微孢子虫20s PS（EQB61106.1）聚为一支，进化距离最近。研究结果丰富了东方蜜蜂微孢子虫20s PS的信息，并揭示20s PS可能是亲水性蛋白、胞内蛋白和非跨膜蛋白，东方蜜蜂微孢子虫与蜜蜂微孢子虫的20s PS之间的亲缘关系最近，20s PS在东方蜜蜂微孢子虫和其他微孢子虫中具有较高的保守性，为深入开展相关功能研究提供依据。     

意大利蜜蜂Hippo信号通路相关基因及其全长转录本的鉴定与分析

采用Blast工具将已鉴定到的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica，简称意蜂)全长转录本比对Nr数据库，共鉴定到意蜂Hippo信号通路中相关的49个基因及其550条全长转录本。运用Gffcompare软件将鉴定到的Hippo信号通路相关全长转录本与西方蜜蜂参考基因组(Amel_HAv3.1)上注释的转录本进行比较，分别延长西方蜜蜂参考基因组注释到Hippo信号通路的9个基因的5'' UTR和7个基因的3'' UTR。通过Astalavista软件鉴定到Hippo信号通路相关的4个基因的7次可变剪切(AS)事件，包括2次外显子跳跃、2次内含子保留和3次可变5''端剪接。通过PCR验证了1个基因的AS事件真实性。利用TAPIS pipeline鉴定到意蜂Hippo信号通路相关的24个基因含有1个及以上可变多聚腺苷酸化(APA)位点，其中含有1个APA位点的基因数量最多。通过TBtool软件鉴定APA位点上游motif的一致性序列HVNCCNBNDYVDVVHVNDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN。