中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析

【目的】系统鉴定和分析中华蜜蜂(Apis cerana cerana)吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础。【方法】基于前期已获得的高质量中华蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将全长转录本比对Nr数据库筛选出吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本。利用gffcompare软件将全长转录本与东方蜜蜂(Apis cerana)参考基因组上注释的转录本进行比较,鉴定未注释的新基因和新转录本。利用TAPIS pipeline预测和分析吞噬与包囊作用相关基因的可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)位点,并通过TBtools软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。使用Astalavista软件鉴定可变剪接(alternative splicing,AS)事件,并通过IGV浏览器进行结构可视化。通过RT-PCR验证AS事件的真实性。【结果】共鉴定到中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关的基因66个和全长转录本395条,发掘出东方蜜蜂参考基因组未注释的2个新基因和303条新转录本。对参考基因组已注释的34个基因进行了结构优化,分别延伸了18个基因的5′端和12个基因的3′端,同时延长了4个基因的5′端和3′端。共鉴定到含有1个及以上APA位点的吞噬与包囊作用相关基因47个,其中多于5个APA位点的基因最多,为32个。在APA位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为：GRBGCNKSDAACAAYTRBGCBMRNGGBYAYTAYWCNVWNGG。共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的AS事件296次,其中包括131次可变3′端剪接(alternative 3′splice site,A3SS)、85次内含子保留(intron retention,IR)、70次可变5′端剪接(alternative 5′splice site,A5SS)和10次外显子跳跃(exon skipping, ES)。RT-PCR结果显示,扩增的目的片段大小符合预期,证实了随机选择的2次AS事件的真实性。【结论】系统鉴定了中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本以及AS事件和APA位点,优化了东方蜜蜂参考基因组注释的吞噬与包囊作用相关基因的结构。     

意大利蜜蜂Hippo信号通路相关基因及其全长转录本的鉴定与分析

采用Blast工具将已鉴定到的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica，简称意蜂)全长转录本比对Nr数据库，共鉴定到意蜂Hippo信号通路中相关的49个基因及其550条全长转录本。运用Gffcompare软件将鉴定到的Hippo信号通路相关全长转录本与西方蜜蜂参考基因组(Amel_HAv3.1)上注释的转录本进行比较，分别延长西方蜜蜂参考基因组注释到Hippo信号通路的9个基因的5'' UTR和7个基因的3'' UTR。通过Astalavista软件鉴定到Hippo信号通路相关的4个基因的7次可变剪切(AS)事件，包括2次外显子跳跃、2次内含子保留和3次可变5''端剪接。通过PCR验证了1个基因的AS事件真实性。利用TAPIS pipeline鉴定到意蜂Hippo信号通路相关的24个基因含有1个及以上可变多聚腺苷酸化(APA)位点，其中含有1个APA位点的基因数量最多。通过TBtool软件鉴定APA位点上游motif的一致性序列HVNCCNBNDYVDVVHVNDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN。     

玉米ZmcpSRP54基因可变剪接分析

cpSRP54基因在植物叶绿体发育中发挥重要作用。本研究用生物信息学方法对玉米ZmcpSRP54蛋白进行了进化分析,利用RT-PCR方法对玉米ZmcpSRP54基因全长cDNA进行了克隆,进而对其进行可变剪接分析。结果表明,玉米ZmcpSRP54蛋白与其它7个物种的cpSRP54蛋白有很高的相似性。鉴定到玉米ZmcpSRP54基因25个不同转录本,1个为标准剪接转录本,其它24个为可变剪接转录本。24个可变剪接转录本共使用了17种非标准剪接位点,4种可变剪接方式,主要以可变的3′端位点、可变的5′端位点和外显子跳跃3种可变剪接方式为主。预测出18种不同长度的ORF,编码18种不同长度的多肽。11个多肽其保守结构域氨基酸序列发生部分缺失,6个多肽其保守结构域氨基酸序列发生全部缺失,1个编码全新的多肽。这些结果将为玉米ZmcpSRP54基因的功能研究提供重要信息。     

基于RNA-seq数据分析玉米抗虫响应基因的可变剪接事件

采用Illumina Hiseq~(TM)分别对黏虫取食的玉米叶片及对照组材料进行转录组测序,鉴定和分析响应黏虫取食基因的可变剪接事件。结果表明,对照组中鉴定出15 701个基因对应79 363个可变剪接事件,黏虫取食组中鉴定到11 791个基因的39 385个可变剪接事件。2组玉米基因组在不同的可变剪接类型中,均是以第1个外显子可变剪切、最后1个外显子可变剪切、单内含子滞留和可变5′或3′端剪切4种类型为主。对2组发生可变剪接事件的基因进行比对发现,黏虫处理组新增加了1 121个可变剪接基因,差异表达分析鉴定出177个表达显著差异的可变剪接基因。GO功能富集分析表明,发生可变剪接的差异基因主要富集于氧化还原酶活性、转移酶活性、DNA结合、ATP结合、代谢过程、以DNA为模板的转录及调控相关的功能,表明这些可变剪接差异表达基因参与了玉米的抗虫响应过程。     

简州大耳羊早期胎儿到新出生阶段背最长肌中可变剪接的鉴定与分析

可变剪接广泛存在于动植物的各个组织中,是形成动植物体内蛋白质多样性和复杂性的重要机制之一。以简州大耳羊为研究对象,采集母羊妊娠期第45天、60天、105天胎儿以及出生后第3天羔羊的背最长肌组织,进行转录组测序。测序数据经比对、组装后,共鉴定出来自于4 562个(16.77%)已注释基因的137 308个可变剪接事件。其中,所占比例最高的类型为外显子跳跃(30.64%),而3′端可变剪接位点、内含子保留、5′端可变剪接位点的比例分别为19.47%、18.07%和10.92%。对RBMs、HNRNPs和SRSFs 3类可变剪接调控因子中58个基因表达量分析表明,19个基因的表达量呈现显著差异(P0.05);其中15个基因在妊娠期第45天和第60天的表达量显著高于其他2个阶段。GO功能注释和富集分析结果表明,4个阶段均发生可变剪接的基因显著富集在细胞表达调控和物质合成等过程(P0.05)。值得注意的是,在妊娠期第60天,可变剪接事件、可变剪接基因的数量和可变剪接因子表达量均显著高于其他阶段,并且特异性基因显著富集在有丝分裂和大分子合成相关过程。上述结果表明,妊娠期第60天胎儿的成肌过程非常活跃,暗示可变剪接在山羊背最长肌发育过程中具有重要作用,为深入探索可变剪接在山羊肌肉发育中的作用提供理论依据。     

山羊5个组织的全长转录组构建与分析

【目的】构建山羊（Capra hircus）全长转录组,旨在改进参考基因组的功能注释。【方法】利用PacBio长读段测序技术对南江黄羊肝、脾、肾周脂肪、背最长肌和睾丸5个组织的混合样本进行高通量测序;对原始数据进行校正、聚类去冗余,最后用KEGG数据库对预测转录本序列进行功能注释。【结果】质控后获得28 432条高质量一致性全长序列,其中99.49%的序列被成功比对到山羊基因组;得到源自9 879个基因的19 115个转录本。进一步分析得到表达基因总数的41.39%发生了可变剪接;其中起始外显子可变剪接占比最高（36.47%）,外显子互斥占比最低（1.78%）。另外,144条序列未被比对到参考基因组上,这些序列的平均GC含量高达56.50%;利用KEGG数据库对其进行功能注释,揭示28个转录本与免疫系统相关。【结论】获得的测序数据全面涵盖混合样本中表达的转录本,证明了山羊基因组转录的复杂性。研究结果总体上提高了每个基因平均表达的转录本数量,证明可变剪接的广泛存在;未成功比对的转录本序列GC含量较高且许多转录本来自免疫基因的表达。     

基于纳米孔全长转录组数据完善东方蜜蜂微孢子虫的基因组注释

【目的】利用已获得的纳米孔全长转录组数据对现有的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）参考基因组的基因序列和功能注释进行完善。【方法】采用TransDecoder软件预测东方蜜蜂微孢子虫基因的开放阅读框（open reading frame,ORF）及相应的氨基酸。利用gffcompare软件将全长转录本与参考基因组注释的转录本进行比较,对基因组注释基因的非编码区向上游或下游延伸,修正基因的边界。利用MISA软件鉴定长度在500 bp以上的全长转录本的简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点,包括单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复、五核苷酸重复、六核苷酸重复、混合SSR等类型。通过Blast工具将鉴定到的新基因和新转录本比对Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库,从而获得功能注释。【结果】共预测出2 353个完整ORF,其中长度分布在0—100个氨基酸的ORF最多,占总ORF数的72.12%。共对东方蜜蜂微孢子虫的2 340个基因进行了结构优化,其中5′端延长的基因有1 182个,3′端延长的基因有1 158个。共鉴定到1 658个SSR,其中单核苷酸重复、双核苷酸重复、三核苷酸重复、四核苷酸重复的数量分别为1 622、23、7和6个;单核苷酸重复类型的SSR密度最大,达到182.32个/Mb,其次为混合SSR、双核苷酸重复和三核苷酸重复,分别达到6.90、2.78和0.73个/Mb。共鉴定出954个新基因,其中分别有951、333、371、422和321个新基因可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。此外,还鉴定出6 164条新转录本,其中分别有6 141、2 808、2 932、3 196和2 585条新转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG数据库。新基因和新转录本注释数量最多的物种均为东方蜜蜂微孢子虫,其次是蜜蜂微孢子虫（Nosema apis）。【结论】研究结果较好地完善了现有的东方蜜蜂微孢子虫参考基因组已注释基因的序列和功能注释,并补充和注释了大量参考基因组未注释的新基因和新转录本。     

意大利蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫的可变剪接基因分析

为探讨可变剪接基因在宿主响应球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫过程中的作用,基于前期已获得的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)幼虫肠道转录组数据进行可变剪接基因分析。在正常的意蜂4日龄幼虫肠道(AmCK),球囊菌胁迫的意蜂4、5和6日龄幼虫肠道(AmT1、AmT2、AmT3)中共鉴定出55 895个可变剪接事件,以外显子跨越和可变3′端剪接为主。各样品的共有可变剪接基因数为8 157个,AmT1、AmT2、AmT3的特有可变剪接基因数分别为207、334和542个。GO分类结果显示共有可变剪接基因分布在50个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,共有可变剪接基因富集在290个pathway,基因富集数最多的是内质网蛋白加工、RNA运输和碳代谢。上述分析结果揭示了可变剪接基因在意蜂幼虫肠道响应球囊菌胁迫过程中的重要作用,为深入研究可变剪接基因的功能打下了基础。     

蜜蜂球囊菌基因结构优化及新基因鉴定

为补充和完善蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis基因组序列和功能注释信息,本研究利用RNA-seq技术对球囊菌菌丝和孢子进行深度测序,并基于高质量的转录组数据对已注释基因进行结构优化,对未注释基因进行预测、鉴定和分析。将测序得到的有效读段进行参考基因组比对和转录本重构;利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对。结果表明:共对101个已注释基因的5′端或3′端进行了延长;共鉴定出373个新基因,随机挑选10个新基因进行RT-PCR验证,其中8个能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的多数新基因真实存在;共计147个球囊菌新基因可注释到Nr和eggNOG数据库中,85个新基因注释到29个GO条目,66个新基因注释到33条代谢通路。本研究结果补充了球囊菌的基因结构和功能注释信息,也为新基因的功能研究打下了初步基础。     

基于中华蜜蜂幼虫肠道转录组数据对东方蜜蜂基因组的基因结构优化及新基因鉴定

利用前期获得的中华蜜蜂(Apis cerana cerana)幼虫肠道转录组数据对东方蜜蜂(Apis cerana)基因组的已注释基因进行结构优化、对未注释的新基因进行预测、分析和鉴定:利用Cufflink软件对reads进行转录本重构,通过与参考转录本序列进行比较,共对3 366个东方蜜蜂的基因结构进行了优化;利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对,共预测出527个东方蜜蜂的新基因,其中234个新基因在Nr数据库中存在注释信息;随机选取12个新基因进行PCR鉴定,有11个能够扩增出符合预期的目的片段,表明多数预测出的新基因真实存在;GO分类和KEGG代谢通路分析结果显示上述新基因可能在东方蜜蜂的生长发育、物质代谢、遗传信息传递等方面具有重要功能。本研究结果丰富和完善了东方蜜蜂基因组的基因结构与功能注释信息,也为新基因的功能研究打下基础。     

基于比较转录组学分析揭示中华蜜蜂及意大利蜜蜂幼虫的球囊菌抗性差异机制

为探究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称中蜂)与意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,以下简称意蜂)幼虫的球囊菌(Ascospahaera apis)抗性差异产生的原因,利用Venn分析、GO分类分析、KEGG代谢通路分析以及Ka/Ks分析对二者的转录组进行比较研究。Venn分析结果显示,中蜂与意蜂的同源基因有17 656个,归属于8 111个基因家族,二者的特有基因分别有1 158和241个,分别归属于468和86个基因家族。GO分类结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集在38和28个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集于96和21个代谢通路;进一步分析发现中蜂的特有基因富集在内吞作用、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和黑化作用等4个细胞免疫通路,以及MAPK信号通路和Toll-like受体信号通路等2个体液免疫通路,而意蜂仅有1个特有基因富集在MAPK信号通路。Ka/Ks分析结果显示受到强烈正向选择、弱正向选择、中性选择和负向选择的单拷贝同源基因分别有37、281、2 630和3 269个。对受到强烈正向选择的基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析,GO结果显示中蜂和意蜂的单拷贝同源基因富集的GO条目类型相同;KEGG结果显示中蜂的单拷贝基因仅富集在氧化磷酸化。上述结果表明免疫相关基因数量的差异是二者的球囊菌抗性差异产生的重要原因之一,中蜂在与球囊菌的协同进化过程中可能通过提高能量利用从而限制球囊菌的增殖。本研究结果可为阐明中蜂及意蜂幼虫的球囊菌抗性差异产生的分子机制提供参考。     

中华蜜蜂蜂毒蛋白酶基因cDNA片段的克隆及序列分析

为从中华蜜蜂蜂毒中扩增蛋白酶(Protease)基因,根据意大利蜜蜂蜂毒蛋白酶基因(GenBank登录号NM_001011584)的保守区设计引物,从中华蜜蜂(Apis cerana cerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA,将从毒腺中扩增出的产物克隆到pGEM-T easy 载体上,导入大肠杆菌JM109,阳性克隆经双酶切鉴定后测序,将测序得到的中华蜜蜂蛋白酶基因与已知的意大利蜜蜂核苷酸序列比较,同源性为95.22%.氨基酸序列分别与意大利蜜蜂、玉米螟、胡蜂、冈比亚按蚊、棉铃象甲虫、埃及斑蚊、热带爪蟾、棕尾别麻蝇、广盐螯虾、亚马逊蝮蛇进行同源性比较,同源性分别为91.71%、46.70%、41.94%、41.21%、39.56%、38.38%、37.35%、36.17%、34.24%、28.49%.本试验首次成功从中华蜜蜂工蜂毒腺中扩增到长度为545 bp、编码蛋白酶的基因片段, 所得序列已提交GenBank,登录号为:EF547156,这为以后克隆该基因全长序列以及利用基因工程技术进行蜂毒产业化开发奠定一定的基础.     

中蜂与意蜂营养杂交后代随机扩增多态DNA研究

以中华蜜蜂(Apis cerdna cerana Fabricius)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica Spinola)为实验材料,进行中华蜜蜂与意大利蜜蜂营养杂交,然后运用随机扩增多态DNA(RAPD)技术检测亲本和营养杂交后代的DNA多态性.结果表明:经过营养杂交,亲本蜜蜂与营养杂交子代的遗传相似系数变小,中华蜜蜂和意大利蜜蜂的特有DNA条带发生了转移.说明通过营养杂交,基因可能发生了转移.     

蜜蜂蜂群中未受精卵的辨认与监督

以中华蜜蜂和意大利蜜蜂为实验材料,研究了中华蜜蜂群间以及中华蜜蜂与意大利蜜蜂种间未受精卵的辨认与监督行为特性。结果表明:中华蜜蜂蜂群中工蜂对群间未受精卵的辨认与监督效果差异不显著,卵的剩余率都在93%以上;但在中华蜜蜂蜂群中,工蜂在2 h之内把意大利蜜蜂未受精卵全部清理,而保留了89%以上的中华蜜蜂未受精卵;在意大利蜜蜂蜂群中,工蜂会在4 h之内把中华蜜蜂未受精卵全部清理,但保留了94%的意大利蜜蜂未受精卵。     

中蜂雄蜂封盖气孔结构及功能分析

以中华蜜蜂和意大利蜜蜂为实验材料,利用扫描电镜观察中蜂雄蜂封盖气孔形成过程和不同封盖结构,利用全自动数字式物透气量仪测定不同封盖透气性。结果表明:中蜂雄蜂封盖第7天,已形成气孔结构,直径0.4~0.5 mm;中蜂雄蜂封盖透气性显著低于中蜂工蜂、意蜂工蜂和雄蜂、封盖,并且中蜂雄蜂封盖质地结构紧密。人工封盖中蜂雄蜂气孔实验表明:中蜂雄蜂封盖气孔对雄蜂发育有一定影响。     

中华蜜蜂幼虫肠道参考转录组的de novo组装及SSR分子标记鉴定

【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫肠道参考转录组进行de novo组装,并进行功能及代谢通路注释,进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫,将纯化的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)孢子饲喂3日龄幼虫,剖取4、5和6日龄幼虫肠道,液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染球囊菌的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads,利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx(E-value10-5)比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库,对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物,通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads,de novo组装得到43 557个unigenes,平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库,单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示,11 442条unigenes分布于25个基因家族,其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多,达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示,在生物学进程分类中,注释到细胞进程的基因最多,达4 201个,在分子功能和细胞组分类中,注释到结合与细胞的基因数最多,分别为4 935和2 900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路,注释到核糖体的基因数最多,达385个。利用MISA软件,可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点,随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增,有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组,可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息,也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组,基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记,可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究,也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。