基于中华蜜蜂幼虫肠道转录组数据对东方蜜蜂基因组的基因结构优化及新基因鉴定

利用前期获得的中华蜜蜂(Apis cerana cerana)幼虫肠道转录组数据对东方蜜蜂(Apis cerana)基因组的已注释基因进行结构优化、对未注释的新基因进行预测、分析和鉴定:利用Cufflink软件对reads进行转录本重构,通过与参考转录本序列进行比较,共对3 366个东方蜜蜂的基因结构进行了优化;利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对,共预测出527个东方蜜蜂的新基因,其中234个新基因在Nr数据库中存在注释信息;随机选取12个新基因进行PCR鉴定,有11个能够扩增出符合预期的目的片段,表明多数预测出的新基因真实存在;GO分类和KEGG代谢通路分析结果显示上述新基因可能在东方蜜蜂的生长发育、物质代谢、遗传信息传递等方面具有重要功能。本研究结果丰富和完善了东方蜜蜂基因组的基因结构与功能注释信息,也为新基因的功能研究打下基础。     

中华蜜蜂幼虫肠道参考转录组的de novo组装及SSR分子标记鉴定

【目的】利用RNA seq技术对中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫肠道参考转录组进行de novo组装,并进行功能及代谢通路注释,进而利用该转录组数据进行中蜂幼虫的SSR分子标记鉴定。【方法】实验室条件下饲养中蜂幼虫,将纯化的蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)孢子饲喂3日龄幼虫,剖取4、5和6日龄幼虫肠道,液氮速冻。将健康幼虫肠道与感染球囊菌的幼虫肠道同时进行Illumina测序。通过对raw reads的过滤得到clean reads,利用Trinity软件组装得到unigenes。通过BLASTx(E-value10-5)比对NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库,对unigenes进行功能和代谢通路注释。利用MISA软件对所有unigenes进行SSR搜索,并利用Primer Premier 5软件设计特异性SSR引物,通过常规PCR对来源于北京、辽宁兴城和四川成都的中蜂幼虫肠道样本进行SSR位点鉴定。【结果】中蜂幼虫肠道的RNA seq共得到35 670 000条reads,de novo组装得到43 557个unigenes,平均长度为898 nt。共有18 225个unigenes可被注释到上述公共蛋白数据库,单独注释到NCBI Nr、Swiss-Prot、KOG和KEGG数据库的unigenes数分别为3 899、443、37和10个。KOG注释结果显示,11 442条unigenes分布于25个基因家族,其中注释到RNA加工和修饰家族的基因数最多,达1 249个。9 679个unigenes的GO分类结果显示,在生物学进程分类中,注释到细胞进程的基因最多,达4 201个,在分子功能和细胞组分类中,注释到结合与细胞的基因数最多,分别为4 935和2 900个。4 517个unigenes可注释到KEGG数据库中的216个代谢通路,注释到核糖体的基因数最多,达385个。利用MISA软件,可在7 763个unigenes搜索到13 448个SSR位点,随机选取20对SSR引物对国内3个不同来源的中蜂幼虫肠道样本的SSR位点进行扩增,有6对引物可鉴定出SSR分子标记。【结论】成功组装并注释了中蜂幼虫肠道参考转录组,可为中蜂及其幼虫的分子生物学及组学研究提供重要的参考信息,也可用于补充、丰富和检验东方蜜蜂的参考基因组,基于此转录组数据开发出6个中蜂的SSR分子标记,可应用于中蜂的基因图谱构建、基因多样性分析、基因定位等研究,也说明利用转录组数据开发非模式生物SSRs的方法可行。     

蜜蜂球囊菌基因结构优化及新基因鉴定

为补充和完善蜜蜂球囊菌Ascosphaera apis基因组序列和功能注释信息,本研究利用RNA-seq技术对球囊菌菌丝和孢子进行深度测序,并基于高质量的转录组数据对已注释基因进行结构优化,对未注释基因进行预测、鉴定和分析。将测序得到的有效读段进行参考基因组比对和转录本重构;利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对。结果表明:共对101个已注释基因的5′端或3′端进行了延长;共鉴定出373个新基因,随机挑选10个新基因进行RT-PCR验证,其中8个能扩增出符合预期的目的片段,表明预测出的多数新基因真实存在;共计147个球囊菌新基因可注释到Nr和eggNOG数据库中,85个新基因注释到29个GO条目,66个新基因注释到33条代谢通路。本研究结果补充了球囊菌的基因结构和功能注释信息,也为新基因的功能研究打下了初步基础。     

利用第三代纳米孔长读段测序技术构建和注释蜜蜂球囊菌的全长转录组

【目的】利用第三代纳米孔（nanopore）长读段测序技术对蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis,简称球囊菌）的纯化菌丝（Aam）和孢子（Aas）进行测序,构建和注释球囊菌的高质量全长转录组。【方法】通过Oxford Nanopore PromethION平台对Aam和Aas进行测序。利用Guppy软件对原始读段（raw reads）进行碱基识别（base calling）,通过过滤短片段和低质量原始读段得到有效读段（clean reads）。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。通过比对Nr、Swissprot、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG数据库获得全长转录本的注释信息。分别利用CPC、CNCI、CPAT、Pfam 4种方法对长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）进行预测,取四者的交集作为高可信度的lncRNA。【结果】Aam和Aas的纳米孔测序分别测得6 321 704和6 259 727条原始读段,经质控得到5 669 436和6 233 159条有效读段,其中包含的全长有效读段分别为4 497 102（79.32%）和4 963 101（79.62%）条。共鉴定到9 859和16 795条非冗余全长转录本,N50分别为1 482和1 658 bp,平均长度分别为1 187和1 303 bp,最大长度分别为6 472和6 815 bp。Venn分析结果显示有6 512条非冗余全长转录本为菌丝和孢子所共有,分别有3 347和10 283个非冗余全长转录本为二者特有。此外,在球囊菌菌丝和孢子中共鉴定到20 142条全长转录本,其中分别有20 809、11 151、17 723、12 164、11 340和9 833条全长转录本可注释到Nr、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG数据库。注释全长转录本数量最多的物种是球囊菌、Polytolypa hystricis和荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）。GO数据库注释结果显示,上述全长转录本可注释到45个功能条目,涉及细胞组件、细胞和细胞器等细胞组分相关条目;催化活性、结合和转运器活性等分子功能相关条目;以及细胞进程、代谢进程和单一组织进程等生物学进程相关条目。KEGG数据库注释结果显示,上述全长转录本还可注释到抗生素的生物合成、核糖体、氨基酸的生物合成、碳代谢和剪接体等49条通路。此外,鉴定到648条高可信度的lncRNA,包含480条基因间区lncRNA、119条反义链lncRNA和49条正义链lncRNA。【结论】构建和注释了球囊菌的首个高质量全长转录组,为探究球囊菌转录组的复杂性,完善参考基因组的序列和功能注释信息以及深入开展球囊菌可变剪接体的功能研究提供了关键依据。     

3种白鲫杂交子代的转录组学分析

[目的]研究3种白鲫杂交子代转录组学特征,为揭示鲫鲤杂交优势的分子机理提供理论依据,同时为在生产上培育出生长速度快、肉质好、适应能力强的杂交品种提供技术参考.[方法]以白鲫(♀)×黑龙江野鲤(♂)杂交子代(简称HB)、白鲫(♀)×散鳞镜鲤(♂)杂交子代(简称SB)和白鲫(♀)×兴国红鲤(♂)杂交子代(简称XB)为研究对象,利用RNA-seq高通量测序技术构建3种白鲫杂交子代转录组文库,以HiSeq PE150进行测序分析,原始序列经Trinity组装后进行功能注释(E-value<1e-5);以DESeq2 R鉴定差异表达基因,利用GOseq R和KOBAS分别对差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析;并采用MicroSAtellite对转录本中的SSR位点进行挖掘.[结果]共组装得225858条unigenes,平均长度为668 bp,N50为938 bp,有171461条unigenes可注释到蛋白质数据库(Nr)、非冗余核苷酸数据库(Nt)、蛋白质序列数据库(SwissPort)、基因本体论(GO)、直系同源基因簇(COG/KOG)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中,注释比例为75.92%.其中,52630条unigenes注释到NR数据库,43659条unigenes注释到SwissPort数据库,35756条unigenes注释到COG/KOG数据库,包括生化代谢、信号转导机制、防御系统和细胞结构等.差异表达基因KEGG分析结果显示,较多的差异表达基因注释到内吞作用、Jak-STAT信号通路、溶酶体、吞噬体和Wnt信号通路等免疫相关及与生长发育相关的MAPK信号通路、Hippo信号通路和背腹轴形成等通路中.此外,从获得的转录组序列中共鉴定出20272个SSR位点,大多数为二核苷酸重复基元(占62.15%).[结论]不同白鲫杂交子代间存在较多的差异表达基因,从中获得参与抗氧化、免疫和生长发育相关的通路和基因序列,且挖掘出20272个SSR位点,有助于选择性育种、分子标记开发及开展遗传多样性、遗传图谱构建和QTL定位等研究.     

中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析

【目的】系统鉴定和分析中华蜜蜂(Apis cerana cerana)吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础。【方法】基于前期已获得的高质量中华蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将全长转录本比对Nr数据库筛选出吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本。利用gffcompare软件将全长转录本与东方蜜蜂(Apis cerana)参考基因组上注释的转录本进行比较,鉴定未注释的新基因和新转录本。利用TAPIS pipeline预测和分析吞噬与包囊作用相关基因的可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)位点,并通过TBtools软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。使用Astalavista软件鉴定可变剪接(alternative splicing,AS)事件,并通过IGV浏览器进行结构可视化。通过RT-PCR验证AS事件的真实性。【结果】共鉴定到中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关的基因66个和全长转录本395条,发掘出东方蜜蜂参考基因组未注释的2个新基因和303条新转录本。对参考基因组已注释的34个基因进行了结构优化,分别延伸了18个基因的5′端和12个基因的3′端,同时延长了4个基因的5′端和3′端。共鉴定到含有1个及以上APA位点的吞噬与包囊作用相关基因47个,其中多于5个APA位点的基因最多,为32个。在APA位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为：GRBGCNKSDAACAAYTRBGCBMRNGGBYAYTAYWCNVWNGG。共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的AS事件296次,其中包括131次可变3′端剪接(alternative 3′splice site,A3SS)、85次内含子保留(intron retention,IR)、70次可变5′端剪接(alternative 5′splice site,A5SS)和10次外显子跳跃(exon skipping, ES)。RT-PCR结果显示,扩增的目的片段大小符合预期,证实了随机选择的2次AS事件的真实性。【结论】系统鉴定了中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本以及AS事件和APA位点,优化了东方蜜蜂参考基因组注释的吞噬与包囊作用相关基因的结构。     

中华蜜蜂酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶相关基因 及其全长转录本发掘与分析

为深入开展中华蜜蜂相关研究提供参考信息和基础,利用已获得的纳米孔(Nanopore)测序数据对中华蜜蜂Apis cerana cerana的酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)相关基因和全长转录本进行发掘和分析。通过Blast工具将中华蜜蜂所有全长转录本比对KEGG和Nr数据库以筛选出PO和SP相关基因和全长转录本。采用gffcompare软件将PO和SP相关全长转录本与东方蜜蜂参考基因组(ACSNU-2. 0)已注释基因进行比较以优化结构。使用Astalavista软件鉴定PO和SP相关基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件,再利用IGV浏览器进行结构可视化。通过PCR验证AS事件的真实性。利用TAPIS pipeline预测和分析可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)位点,并通过TBtool软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因与146条转录本。优化了16个参考基因组已注释PO和SP相关基因的结构,其中5′端延长和3′端延长的基因均有7个,5′端和3′端同时延长的基因有2个。鉴定到PO和SP相关的10个基因的389次AS事件,其中最丰富的AS类型是5′端可变剪接。PCR结果证实了2次AS事件的真实性。共鉴定到34个PO和SP相关基因含有1个及以上的APA位点,其中含有3个APA位点的基因数量最多;在APA位点上游鉴定到多个motif,一致性序列为：GGHKSYWSHHTRATWTCNBHDMRRYWYRTNYTVACNGCKGCDCAYTGYR。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因和146条全长转录本,优化了东方蜜蜂参考基因组已注释的PO和SP相关基因结构,并发掘出PO和SP相关基因的389次AS事件和237个APA位点。     

意大利蜜蜂Hippo信号通路相关基因及其全长转录本的鉴定与分析

采用Blast工具将已鉴定到的意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica，简称意蜂)全长转录本比对Nr数据库，共鉴定到意蜂Hippo信号通路中相关的49个基因及其550条全长转录本。运用Gffcompare软件将鉴定到的Hippo信号通路相关全长转录本与西方蜜蜂参考基因组(Amel_HAv3.1)上注释的转录本进行比较，分别延长西方蜜蜂参考基因组注释到Hippo信号通路的9个基因的5'' UTR和7个基因的3'' UTR。通过Astalavista软件鉴定到Hippo信号通路相关的4个基因的7次可变剪切(AS)事件，包括2次外显子跳跃、2次内含子保留和3次可变5''端剪接。通过PCR验证了1个基因的AS事件真实性。利用TAPIS pipeline鉴定到意蜂Hippo信号通路相关的24个基因含有1个及以上可变多聚腺苷酸化(APA)位点，其中含有1个APA位点的基因数量最多。通过TBtool软件鉴定APA位点上游motif的一致性序列HVNCCNBNDYVDVVHVNDBVDYCNBBDNNNHNNVNNVMNN。     

苦茶全长转录组测序及基因结构分析

为进一步探究苦茶特异性状形成的遗传基础,基于PacBio对苦茶进行Iso-Seq,最终得到Polished consensus序列132 334个,其中有26 184个为已知基因的新转录本,7 115个为新基因,同时鉴定得到21 106个SSR位点;基因结构分析结果中,4 892个基因发生了可变剪切事件,其中内含子滞留事件占比最大;预测得到1 918个新的转录因子,778个LncRNA。比较KEGG(10 976+5 626)、KOG(6 296+1896)、GO(6 221+575)3大数据库功能注释情况,发现注释到KEGG的转录本数最多,其中多个转录本注释到与茶叶品质和苦茶特异性状形成相关的代谢途径,如苦茶碱等嘌呤生物碱代谢(74+17)、氨基酸代谢(409+69)、苯丙烷生物合成(70+18)和萜类物质生物合成(152+31)等(括号内数值为未比对到基因组的转录本和新转录本数量)。这些发现将有助于苦茶特异性状相关基因标记的开发、并为其形成的机理及遗传机制的研究奠定基础。     

西方蜜蜂的基因注释信息优化及新基因鉴定

西方蜜蜂(Apis mellifera)全基因组序列早在2006年就已公布,但其基因注释信息并不完善。本研究利用前期获得的意蜂幼虫肠道RNA-seq数据对西方蜜蜂基因组的已知基因进行结构优化,对新基因进行预测、鉴定和分析。利用Cufflink软件进行转录本重构,进而与参考转录本序列进行比较,共对4 177个已公布西方蜜蜂基因的测序结果进行了优化,其中5′端延长、3′端延长、5′和3′端都延长的基因分别有2 383、2 392和2 384个。利用Cuffcompare软件将重构转录本与参考基因组进行比对,共预测出197个西方蜜蜂新基因,随机挑选20个新基因进行RT-PCR验证,有18对引物成功扩增出符合预期的目的片段。GO分类结果显示这些新基因涉及运输和代谢、能量代谢和信号分子和交互等21个GO terms。KEGG代谢通路(pathway)富集分析结果显示这些新基因富集于13个pathways,其中基因富集数最多的是细胞进程、单一有机体和结合。本研究为西方蜜蜂基因组信息提供了有益的补充和完善,也为新基因的功能研究打下了基础。     

东方蜜蜂微孢子虫孢子中长链非编码RNA的竞争性内源RNA调控网络及潜在功能

【背景】 长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度>200 nt且不具有编码能力的转录本,能够在真核生物的转录水平和转录后水平通过顺式（cis）、反式（trans）或竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）机制调控基因的表达,已被证明在生物体的生长和发育等生物学过程中发挥重要的调控作用。【目的】 结合测序得到的东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子的small RNA（sRNA）组学数据和前期获得的lncRNA组学数据对lncRNA的调控方式进行深入细致的分析和探讨,揭示lncRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中的潜在功能。【方法】 利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子进行测序,通过相关的生物信息学软件对测序数据进行质控。根据lncRNA与mRNA的位置关系预测lncRNA的上下游基因;使用Blast软件比对GO和KEGG数据库,对上下游基因进行功能和代谢通路注释;利用Target Finder软件预测lncRNA-miRNA及lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,进而通过Cytoscape v3.7.2软件对调控网络进行可视化;利用RT-PCR对调控网络中的部分lncRNA、miRNA和mRNA的表达进行验证。【结果】 东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子样品的sRNA-seq分别得到16 597 883、15 451 791和12 248 316条raw reads,经质控分别得到15 608 370、14 249 255和11 440 684条clean reads,各样品的Q30≥98.58%。共预测出lncRNA的上下游基因310个,它们可注释到代谢进程、细胞进程、催化活性、结合和细胞等相关的35个功能条目;此外还可注释到56条代谢通路,涉及嘌呤代谢、碳代谢和丙酮酸代谢等物质代谢通路,以及甲烷代谢、氧化磷酸化和糖酵解/糖异生等能量代谢通路。上述结果表明相应的lncRNA可能通过cis作用调节上下游基因的表达,从而参与调控东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢以及细胞生命活动。进一步构建lncRNA-miRNA调控网络,分析结果显示MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1可靶向结合4个miRNA（nce-miR-7729、nce-miR-7502、nce-miR-8639和nce-miR-8565）,说明此3个lncRNA可作为ceRNA在东方蜜蜂微孢子虫孢子中发挥潜在作用。LncRNA-miRNA-mRNA调控网络分析结果显示,三者之间形成较为复杂的调控网络关系,miRNA处于调控网络的中心并联系lncRNA和mRNA,nce-miR-7502和nce-miR-8639结合的mRNA最多,达到28个;与MSTRG.3636.1、MSTRG.4498.1和MSTRG.4883.1存在靶向关系的miRNA结合多个mRNA,表明上述3个lncRNA可能通过ceRNA机制发挥作用,从而影响东方蜜蜂微孢子虫孢子中的新陈代谢和生命活动。【结论】 lncRNA可能通过cis作用调控上下游基因的表达,以及作为ceRNA通过吸附miRNA间接影响靶基因的表达,从而参与调节东方蜜蜂微孢子虫孢子中的物质和能量代谢等基本生命活动。     

金花菜与苜蓿属主要物种基因组SSR分布特征的比较分析

【目的】 分析金花菜基因组SSR序列的分布特征,并与苜蓿属主要物种进行比较,为金花菜SSR分子标记的开发提供理论依据。【方法】 利用MISA软件对金花菜、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的高质量基因组进行搜索,比较分析搜索到的SSR序列分布特征。【结果】 在金花菜、蒺藜苜蓿和紫花苜蓿的基因组中,分别筛选到195 753个,242 434个和390 496个完整的SSR序列,相对密度分别为428、564和478个/Mb,SSR序列的总长度分别为3 611 698、3 657 503和6 307 211 bp,占各自基因组序列总长度的0.79%、0.85%和0.77%。在1~6个不同核苷酸重复单元中,金花菜和蒺藜苜蓿的SSR序列均是单核苷酸重复单元最多,依次是二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸,而紫花苜蓿的六核苷酸重复单元多于五核苷酸重复单元。A、T、AT、TA、AG和TC是3种苜蓿共有的常见重复单元类型,金花菜基因组低片段长度的SSR比例高于蒺藜苜蓿和紫花苜蓿。【结论】 金花菜基因组SSR的分布密度低于蒺藜苜蓿和紫花苜蓿,重复单元类型较丰富,具有较大的多态性标记开发潜力。     

苹果基因组SSR位点分析与应用

 【目的】通过对‘金冠’苹果基因组SSR位点的统计分析,为蔷薇科果树应用SSR分子标记进行高通量的遗传分析提供理论与实践基础。【方法】运用NCBI数据库中‘金冠’苹果基因组数据,分析其SSR位点分布情况,并根据SSR位点的搜索结果,设计68对引物（每条染色体设计4对）,利用苹果品种对所设计引物进行应用性验证并利用梨杂交群体进行通用性检测。【结果】苹果基因组中SSR序列主要是完全重复型,17条染色体共存在163 426个SSR位点,平均每隔3.22 kb存在1个。单核苷酸至三核苷酸重复基序在染色体水平上分布较均匀,而四核苷酸至六核苷酸重复基序的分布差异较大。单核苷酸与二核苷酸重复基序所占比例最大,两者占基因组内SSR位点总数的91.67%,单核苷酸重复基序主要以A/T重复为主,二核苷酸的重复基序主要以AT/TA重复为主。在苹果品种中验证所设计的68对引物,有62对可以扩增出预期目的片段,37对存在扩增多态性。在梨杂交群体上应用所设计的68对引物,有40对具扩增目的片段,其中16对具扩增多态性。【结论】苹果基因组内SSR分布呈现一定的规律性,初步验证SSR位点在亲缘关系较近的物种间高度保守并可以通用,基于基因组数据发掘SSR位点用于后续的相关遗传研究具有可行性。     

微小RNA介导东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的分子机制

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子与侵染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂的东方蜜蜂微孢子虫的差异表达miRNA（DEmiRNA）及其靶mRNA进行系统分析,筛选、分析和探讨病原毒力因子和侵染因子相关的DEmiRNA及调控网络,在miRNA组学层面揭示东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的侵染机制。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫感染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠和东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子（NcCK）进行深度测序,通过连续比对rRNA数据库、西方蜜蜂（Apis mellifera）基因组和东方蜜蜂微孢子虫基因组筛滤出处于侵染过程的东方蜜蜂微孢子虫（NcT1和NcT2）数据和东方蜜蜂微孢子虫孢子的测序数据。根据P≤0.05,|log₂ fold change|≥1的标准,通过比较分析筛选出各比较组中的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）。通过相关生物信息学软件对DEmiRNA进行表达谱分析,靶mRNA预测及功能和代谢通路注释,以及调控网络的构建与分析。通过Stem-loop RT-qPCR验证DEmiRNA的差异表达趋势及测序数据的可靠性。【结果】NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别包含164、122和60个DEmiRNA。Venn分析结果显示,3个比较组共有的上调和下调miRNA分别为5和6个。上述DEmiRNA分别预测出1 885、1 733和1 524个靶mRNA。这些靶mRNA分别注释到27、25和26个功能条目,其中注释数量最多的是新陈代谢进程、催化活性、细胞进程、结合和细胞。上述靶mRNA可分别注释到84、84和84条代谢通路,其中注释数量最多的是代谢途径、核糖体和次级代谢产物生物合成。此外,对于NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2中的DEmiRNA,分别有35、26和12个靶向结合MAPK信号通路相关靶mRNA,分别有49、40和17个DEmiRNA靶向结合糖酵解/糖异生通路相关靶mRNA。进一步分析发现,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA参与调控蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等病原毒力因子的基因表达,以及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子的基因表达。【结论】通过对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子与侵染意蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫进行深入细致的miRNA组学分析和探讨,解析了病原侵染过程的miRNA差异表达谱,揭示了东方蜜蜂微孢子虫可能通过调节相应miRNA的表达水平对蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等毒力因子及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子基因表达进行调控,从而适应宿主细胞内的环境并促进自身的增殖与侵染。     

基于RNA-seq数据的栽培种花生SSR位点鉴定和标记开发

【目的】鉴定花生RNA-seq数据中的SSR位点,明确转录组中SSR位点的分布和结构特点,开发与花生基因相关联的SSR标记,为花生重要功能基因的挖掘、等位变异研究和分子标记辅助育种奠定基础。【方法】根据栽培种花生全生育期中22种不同类型的组织RNA-Seq数据,使用MISA软件分析SSR位点分布及特征,采用Primer 3设计基因关联的SSR引物,并利用电子PCR软件对引物的质量进行检测,随机合成38对引物,进行多态性检测。【结果】从52 280条转录本中共鉴定19 143个SSR位点,分布于14 084条转录本,发生频率为26.94%。重复单元类型为单核苷酸—五核苷酸,以单核苷酸和三核苷酸为重复单元的SSR位点数最多,分别占位点总数的39.24%和38.40%。各重复单元优势基序类型分别为A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT和AACAC/GTGTT,占所在重复单元中的比例分别为97.62%、72.01%、30.96%、24.59%和16.67%。重复单元的重复次数为5—47次,单个SSR位点的长度的分布范围为10—47 bp,基序长度主要集中在10—14 bp;复合SSR位点的长度范围为21—249 bp,以31—40 bp为主。鉴定的SSR位点中共有13 477个SSR位点可以进行引物设计,其中5 020条转录本序列对应到特定的基因,共包含5 859个可进行引物设计的SSR位点,这些SSR位点在A基因组和B基因组共20条染色体上不均匀分布,其中B03染色体上SSR位点最多,为484个。对特定基因SSR引物进行电子PCR检测,在A.duranensis、A.ipaensis、A.hypogaea基因组中有效扩增位点分别为4 468、4 929和10 188个,有效引物数分别为3 968（67.74%）、4 232（72.25%）和5 174（88.33%）对,在A. hypogaea基因组中,SSR引物扩增位点主要以2个位点为主,其中,有1 477对引物单位点扩增。根据SSR引物扩增位点在栽培种花生基因组中的位置信息绘制了SSR位点的物理图谱。在38对SSR引物中,共有35对（92.1%）SSR引物可以扩增出清晰的条带,其中,有11对（28.9%）SSR引物在2个品种间扩增出差异条带。【结论】鉴定了13 477个可进行标记开发的SSR位点,开发、检测了5 859个基因相关SSR标记,在栽培种花生基因组中具有较高的扩增效率,并构建了基因相关SSR位点的物理图谱。     

微小RNA介导意大利蜜蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的跨界调控

【目的】东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）感染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）导致蜜蜂微孢子虫病。本研究结合前期已获得的miRNA和mRNA组学数据,通过生物信息学方法对意蜂工蜂中肠的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）靶向结合的东方蜜蜂微孢子虫的mRNA和差异表达mRNA（DEmRNA）进行预测、数据库注释和调控网络分析,以期在组学水平解析miRNA介导意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的跨界调控机制。【方法】通过比较东方蜜蜂微孢子虫侵染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠（AmT1、AmT2）和未受侵染的工蜂中肠（AmCK1、AmCK2）的miRNA组学数据筛选出宿主的显著性DEmiRNA,通过比较侵染意蜂工蜂中肠的东方蜜蜂微孢子虫（NcT1、NcT2）和东方蜜蜂微孢子虫纯净孢子（NcCK）的mRNA数据筛选出病原的DEmRNA。利用TargetFinder软件预测宿主显著性DEmiRNA靶向结合的病原mRNA和DEmRNA。利用相关生物信息学工具对上述靶DEmRNA进行GO和KEGG数据库注释。结合前期研究结果筛选出孢壁蛋白、极管蛋白、蓖麻毒素B凝集素、ABC转运蛋白、ATP/ADP移位酶和糖酵解/糖异生途径等毒力因子和能量代谢通路相关的病原DEmRNA及与其存在靶向结合关系的宿主显著性DEmiRNA,并构建和分析二者的调控网络。【结果】AmCK1 vs AmT1比较组中宿主的48条显著上调miRNA和36条显著下调miRNA分别靶向病原的1 345和1 046条mRNA;进一步分析发现,宿主的47条显著上调miRNA和34条显著下调miRNA可分别靶向NcCK vs NcT1比较组中病原的584条显著下调mRNA和265条显著上调mRNA,它们可分别注释到19和22个功能条目以及66和64条通路。AmCK2 vs AmT2比较组中宿主的56条显著上调miRNA和51条显著下调miRNA分别靶向病原的1 260和1 317条mRNA;进一步分析发现,宿主的52条显著上调miRNA和49条显著下调miRNA可分别靶向NcCK vs NcT2比较组中病原的587条显著下调mRNA和336条显著上调mRNA,它们可分别注释到20和23个功能条目以及64和65条通路。AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组的8条共同显著上调miRNA和1条共同显著下调miRNA分别靶向NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中的144条共同显著下调和10条共同显著上调mRNA,可分别注释到18和13个功能条目以及38和7条通路。此外,AmCK1 vs AmT1和AmCK2 vs AmT2比较组中宿主的显著上调miRNA可靶向结合NcCK vs NcT1和NcCK vs NcT2比较组中与RNAi途径,孢壁蛋白和蓖麻毒素B凝集素等毒力因子,糖酵解/糖异生途径以及MAPK信号通路相关的病原下调表达mRNA。【结论】在东方蜜蜂微孢子虫的侵染过程中,意蜂工蜂中肠的DEmiRNA与病原的DEmRNA之间存在复杂的靶向结合关系以及潜在的跨界调控关系;宿主的DEmiRNA可能通过抑制或降解病原的RNAi途径、毒力因子、糖酵解/糖异生通路、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白及MAPK信号通路相关靶DEmRNA影响病原的侵染和增殖。     

意大利蜜蜂响应东方蜜蜂微孢子虫胁迫的免疫应答

【目的】通过对意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂中肠响应东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）胁迫的差异表达基因（differentially expressed gene,DEG）及免疫通路进行深入细致的分析,揭示宿主的细胞和体液免疫应答,为关键免疫应答基因的筛选及功能研究打下基础。【方法】基于前期获得的正常及东方蜜蜂微孢子虫胁迫的意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠（Am7CK、Am7T、Am10CK、Am10T）转录组数据,按照FDR≤1,P≤0.05和|log₂ fold change|≥1的标准筛选出各组的DEG,利用相关生物信息学软件对DEG进行Pearson相关性分析、Venn分析、GO分类和KEGG代谢通路富集分析,进而对免疫通路富集基因进行统计和分析,利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）验证转录组数据的可靠性。【结果】 差异分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组包含472个上调基因和385个下调基因;Am10CK vs Am10T比较组包含611个上调基因和360个下调基因。Venn分析结果显示,两个比较组特有的DEG分别为739和853个,共有的DEG为118个。GO分类结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别涉及23和29个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为结合、催化活性、代谢进程、细胞进程和单组织进程;富集下调基因数最多的前5位分别为代谢进程、单组织进程、催化活性、细胞进程和结合。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别涉及36和26个功能条目,其中富集上调基因数最多的前5位分别为单组织进程、结合、细胞进程、催化活性和代谢活性;富集下调基因数最多的前5位分别为结合、细胞进程、催化活性、代谢进程和单组织进程。KEGG代谢通路富集分析结果显示,Am7CK vs Am7T比较组中上调和下调基因分别富集在38和33条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为胆汁分泌、内质网蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、PI3K-Akt信号通路和神经营养因子信号通路;富集下调基因数最多的前5条分别为胞质DNA传感通路、嘌呤代谢、嘧啶代谢、RNA聚合酶和核糖体;涉及泛素介导的蛋白水解等3条细胞免疫通路,以及PI3K-Akt信号通路等7条体液免疫通路。Am10CK vs Am10T比较组中上调和下调基因分别富集在54和43条代谢通路,富集上调基因数最多的前5条分别为Hippo信号通路、药物代谢-细胞色素P450、P450对外源物质的代谢、泛素介导的蛋白水解和鞘脂类代谢;富集下调基因数最多的前5条分别为mRNA监测、鞘脂类信号通路、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和鞘脂类代谢;涉及泛素介导的蛋白水解等7条细胞免疫通路,以及NF-κB信号通路等2条体液免疫通路。RT-qPCR验证结果显示6个随机挑选的DEG的表达量变化趋势与测序结果一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。进一步分析发现意蜂7日龄和10日龄工蜂中肠的NF-κB信号通路均被东方蜜蜂微孢子虫激活,随即启动了3种抗菌肽apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin的合成,体现了它们在宿主抵御东方蜜蜂微孢子虫入侵中的重要性。【结论】在转录组水平解析了意蜂工蜂中肠对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答,揭示宿主在胁迫前期同时作出细胞和体液免疫应答,前者可能在抵御病原入侵方面发挥主要作用;宿主的细胞免疫在胁迫后期持续增强,但体液免疫较大程度地减弱;泛素介导的蛋白水解通路及富集DEG,NF-κB信号通路及富集DEG,以及抗菌肽编码基因apidaecin、defensin-1和hymenoptaecin可能在意蜂工蜂对东方蜜蜂微孢子虫的免疫应答中起到关键作用。     

柴胡转录组SSR的分布及序列特征分析

【目的】分析柴胡转录组中SSR的分布及序列特征,为开发多态性良好的、功能基因相关的SSR标记提供理论依据。【方法】以不同温度处理的柴胡种子为材料,经高通量转录组测序后,使用Trinity对测序结果进行de novo组装,并利用MISA对组装得到的Unigenes进行SSR位点搜索,最后统计分析SSR的分布及序列特征。【结果】从转录组数据组装获得244194条Unigenes,其N50值为1036 bp,平均长度791 bp,总长度193138105 bp。从Unigenes序列中共检测到50303个SSR位点,去除20405个复合型SSR位点,以29898个单一型SSR位点为后续分析对象。转录组SSR的出现频率为12.24%,平均分布距离6.46 kb,主要重复基元类型为二核苷酸,共17105个,占SSR总数的57.21%,其次为三核苷酸和单核苷酸,分别占SSR总数的20.75%和20.46%,四核苷酸~六核苷酸重复基元数量均较少。转录组SSR中,共有97种重复基元,其中二核苷酸和三核苷酸重复基元分别以AT/AT和ATC/GAT为主,分别占SSR总数的33.33%和3.98%;重复次数5~10次的SSR位点数量最多,共27942个,占SSR总数的93.46%。转录组SSR序列长度存在明显差异（12~76 bp）,平均长度15.28 bp。【结论】柴胡转录组的SSR位点出现频率较高,类型较丰富,具有开发出高多态性SSR分子标记的潜力,将其用于柴胡的遗传多样性分析、种质资源评价及分子标记辅助育种等研究。