猪副粘病毒感染的电镜诊断及病毒的分离

采用电镜负染技术对长春市某猪场病死仔猪的肠道内容物、肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、脑等组织进行了观察.结果在肠道内容物中发现大量副粘病毒,同时在肾脏、肝脏和肺脏中也发现数量不等的副粘病毒,在脾脏和脑组织中未发现病毒粒子.取肾脏为病料,采用同步培养方法接种于PK细胞系进行病毒的分离培养.结果表明,电镜负染技术可对猪感染副粘病毒进行快速诊断,该方法操作程序简便,速度快,从取样到结果判定在1h之内即可完成.细胞分离培养结果证实此病例中的猪副粘病毒可在PK细胞中克隆增殖,并引起细胞典型的病变(CPE).     

东方蜜蜂微孢子虫蓖麻毒素B凝集素基因的分子克隆及生物信息学分析

为获得东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)的NCRBL-081基因序列,并对NCRBL-081编码蛋白进行预测和分析。本研究利用RT-PCR克隆NCRBL-081基因,利用相关生物信息学工具对NCRBL-081编码蛋白进行预测。结果表明:NCRBL-081共含有630个核苷酸,可编码含209个氨基酸的亲水性蛋白;NCRBL-081编码蛋白含有1个信号肽,6个明显的丝氨酸,5个酪氨酸磷酸化位点及1个跨膜结构域;该蛋白含有20.10%的α螺旋,8.61% 的β折叠,25.84%的延伸链及45.45%的无规卷曲,且具有Ⅱ型核糖体失活蛋白家族的典型特征;同一个微孢子虫物种的不同RBL蛋白之间进化距离较近,而不同微孢子虫物种的RBL蛋白之间进化距离较远;东方蜜蜂微孢子虫的NCER_100581与AAJ76_100008081之间亲缘关系较近。研究结果解析了东方蜜蜂微孢子虫NCRBL-081的序列,并揭示了东方蜜蜂微孢子虫NCRBL-081编码蛋白的分子特征,可为后续功能探究提供依据。     

微小RNA介导东方蜜蜂微孢子虫侵染意大利蜜蜂工蜂的分子机制

【目的】通过对东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）纯化孢子与侵染意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica,简称意蜂）工蜂的东方蜜蜂微孢子虫的差异表达miRNA（DEmiRNA）及其靶mRNA进行系统分析,筛选、分析和探讨病原毒力因子和侵染因子相关的DEmiRNA及调控网络,在miRNA组学层面揭示东方蜜蜂微孢子虫对意蜂的侵染机制。【方法】利用small RNA-seq（sRNA-seq）技术对东方蜜蜂微孢子虫感染7 d和10 d的意蜂工蜂中肠和东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子（NcCK）进行深度测序,通过连续比对rRNA数据库、西方蜜蜂（Apis mellifera）基因组和东方蜜蜂微孢子虫基因组筛滤出处于侵染过程的东方蜜蜂微孢子虫（NcT1和NcT2）数据和东方蜜蜂微孢子虫孢子的测序数据。根据P≤0.05,|log₂ fold change|≥1的标准,通过比较分析筛选出各比较组中的差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）。通过相关生物信息学软件对DEmiRNA进行表达谱分析,靶mRNA预测及功能和代谢通路注释,以及调控网络的构建与分析。通过Stem-loop RT-qPCR验证DEmiRNA的差异表达趋势及测序数据的可靠性。【结果】NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2比较组分别包含164、122和60个DEmiRNA。Venn分析结果显示,3个比较组共有的上调和下调miRNA分别为5和6个。上述DEmiRNA分别预测出1 885、1 733和1 524个靶mRNA。这些靶mRNA分别注释到27、25和26个功能条目,其中注释数量最多的是新陈代谢进程、催化活性、细胞进程、结合和细胞。上述靶mRNA可分别注释到84、84和84条代谢通路,其中注释数量最多的是代谢途径、核糖体和次级代谢产物生物合成。此外,对于NcCK vs NcT1、NcCK vs NcT2和NcT1 vs NcT2中的DEmiRNA,分别有35、26和12个靶向结合MAPK信号通路相关靶mRNA,分别有49、40和17个DEmiRNA靶向结合糖酵解/糖异生通路相关靶mRNA。进一步分析发现,东方蜜蜂微孢子虫的DEmiRNA参与调控蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等病原毒力因子的基因表达,以及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子的基因表达。【结论】通过对东方蜜蜂微孢子虫纯化孢子与侵染意蜂工蜂的东方蜜蜂微孢子虫进行深入细致的miRNA组学分析和探讨,解析了病原侵染过程的miRNA差异表达谱,揭示了东方蜜蜂微孢子虫可能通过调节相应miRNA的表达水平对蓖麻毒素B凝集素、细胞凋亡抑制因子、极管蛋白和孢壁蛋白等毒力因子及己糖激酶、ATP/ADP移位酶、ABC转运蛋白和转录因子ste12等侵染因子基因表达进行调控,从而适应宿主细胞内的环境并促进自身的增殖与侵染。     

旋毛虫T668基因转录及表达的时空特性鉴定

采用RT-PCR和免疫荧光染色技术,分别检测T668基因mRNA及蛋白在旋毛虫不同发育时期中的时空表达情况。RT-PCR结果显示,该基因从旋毛虫新生幼虫出生即开始转录,随着日龄的增加,T668基因mRNA逐渐减少,在感染后11～14 d T668基因的转录趋于停止。免疫荧光染色结果表明,在感染后1d,旋毛虫虫体即有T668蛋白表达;感染后6～13d,T668蛋白分泌到肿大的肌细胞核上;14～20d,肿大的肌细胞核上基本观察不到T668蛋白,但整个虫体仍有很强的蛋白表达。这提示在旋毛虫的寄生过程中,T668基因的转录及表达呈一定的时空特点,这可能对旋毛虫包囊形成有着重要作用。     

短裸甲藻毒素单克隆抗体的制备及其鉴定

采用混合酸酐法将短裸甲藻毒素(brevetoxins,BTX)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清蛋白(BSA)偶联制备人工抗原。以BTX-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合-ELISA筛选抗短裸甲藻毒素的单克隆抗体,并对其特异性和灵敏性进行了鉴定。结果获得了1株可分泌短裸甲藻毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B4,该株杂交瘤细胞腹水抗体效价达10-5,与其他类似物没有交叉反应。该抗体为建立短裸甲藻毒素免疫学检测方法奠定了基础。