基于纳米孔全长转录组数据完善东方蜜蜂微孢子虫的基因组注释

[目的]利用已获得的纳米孔全长转录组数据对现有的东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)参考基因组的基因序列和功能注释进行完善.[方法]采用TransDecoder软件预测东方蜜蜂微孢子虫基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)及相应的氨基酸.利用gffcompare软件将全长转录本与参...     

基于第二代转录组、第三代全长转录组测序条件下草石蚕基因表达特性的初步研究

以宁夏贺兰县地方草石蚕（Stachys sieboldii）品种为试材,探讨应用第三代测序技术获得草石蚕全长转录本信息,应用第二代测序技术获得3个不同发育阶段草石蚕叶片和块茎的转录组信息,对测序结果进行转录组水平分析,筛选特有差异基因,并进行GO和KEGG富集分析,开展草石蚕基因表达特性的初步研究。结果表明,第三代测序后Polymerase read的数据量为50.82 G,FLNC序列的reads数为525 593个转录本;在KEGG等7大数据库的基因功能注释中均注释成功的转录本数目为6 857个,至少有1个数据库注释成功的转录本数目为14 078个;与NR数据库比对注释后,草石蚕与同为唇形目的芝麻（Sesamum indicum）基因序列相似性最高,相似基因个数为9 149个;与GO数据库比对注释后,生物学过程、细胞成分与分子功能中注释到基因个数最多的分别是新陈代谢过程5 093个、细胞2 004个、键联结合6 645个;与KEGG数据库比对注释后,在细胞转化、环境信息处理、遗传信息处理、新陈代谢和有机系统功能中注释到基因数最多的分别是运输和分解代谢409个、信号传导729个、转化...     

中华蜜蜂幼虫肠道响应球囊菌早期胁迫的转录组学

【目的】白垩病是困扰养蜂生产的顽疾。目前,尚无利用二代测序技术研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)幼虫白垩病的报道。本研究利用RNA-seq技术对健康(Ac CK)及球囊菌(Ascosphaera apis)胁迫的中蜂4日龄幼虫肠道(Ac T)进行深度测序,在转录组水平研究中蜂幼虫在球囊菌胁迫早期的胁迫应答。【方法】通过Illumina Hi Seq 2500平台对Ac CK和Ac T进行双端(PE125)测序,首先对测序数据进行质控和评估,利用edge R软件进行差异表达基因(DEG)分析,进而对DEGs进行GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析,最后,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证测序数据的可靠性。【结果】Ac CK和Ac T的转录组测序共得到188 457 338条原始读段(raw reads),经过滤得到182 088 448条有效读段(clean reads),两端Q20与Q30均在97.96%和94.97%以上,说明测序数据质量良好;主成分分析(PCA)结果显示第一与第二主成分可分别解释基因表达总体差异的75.8%和10.7%;DEG分析结果显示上调基因与下调基因的数量分别为344和239个;GO富集分析结果显示DEGs共富集在36个GO分类(term)上,其中基因富集数最多的细胞(106 unigenes)、细胞组件(106 unigenes)和代谢进程(104 unigenes);KEGG代谢通路富集分析结果显示上调与下调基因分别富集在72个和45个代谢通路上,其中上调基因富集数最多的是核糖体(72 unigenes)、碳代谢(16 unigenes)和糖酵解(14 unigenes),而下调基因富集数最多的是碳代谢(9 unigenes)、二羧酸代谢(8 unigenes)和氨基酸生物合成(7 unigenes),进一步分析表明中蜂幼虫肠道的部分细胞免疫对球囊菌的胁迫产生应答,而体液免疫不产生应答,宿主的代谢相关基因受到球囊菌的显著抑制。【结论】揭示了中蜂幼虫在球囊菌入侵早期的胁迫应答,为深入解析中蜂幼虫的胁迫应答机制提供了重要信息,也为在分子水平研究关键应答基因打下了基础。     

基于比较转录组学分析揭示中华蜜蜂及意大利蜜蜂幼虫的球囊菌抗性差异机制

为探究中华蜜蜂(Apis cerana cerana,以下简称中蜂)与意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica,以下简称意蜂)幼虫的球囊菌(Ascospahaera apis)抗性差异产生的原因,利用Venn分析、GO分类分析、KEGG代谢通路分析以及Ka/Ks分析对二者的转录组进行比较研究。Venn分析结果显示,中蜂与意蜂的同源基因有17 656个,归属于8 111个基因家族,二者的特有基因分别有1 158和241个,分别归属于468和86个基因家族。GO分类结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集在38和28个GO条目。KEGG代谢通路富集分析结果显示,中蜂和意蜂的特有基因分别富集于96和21个代谢通路;进一步分析发现中蜂的特有基因富集在内吞作用、溶酶体、泛素介导的蛋白水解和黑化作用等4个细胞免疫通路,以及MAPK信号通路和Toll-like受体信号通路等2个体液免疫通路,而意蜂仅有1个特有基因富集在MAPK信号通路。Ka/Ks分析结果显示受到强烈正向选择、弱正向选择、中性选择和负向选择的单拷贝同源基因分别有37、281、2 630和3 269个。对受到强烈正向选择的基因进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析,GO结果显示中蜂和意蜂的单拷贝同源基因富集的GO条目类型相同;KEGG结果显示中蜂的单拷贝基因仅富集在氧化磷酸化。上述结果表明免疫相关基因数量的差异是二者的球囊菌抗性差异产生的重要原因之一,中蜂在与球囊菌的协同进化过程中可能通过提高能量利用从而限制球囊菌的增殖。本研究结果可为阐明中蜂及意蜂幼虫的球囊菌抗性差异产生的分子机制提供参考。     

基于SMRT技术的水杉全长转录组分析及基因功能注释

以水杉原生种为材料,提取其幼嫩植株的根、茎和叶的总RNA,经m RNA纯化、反转录、全长转录组文库构建等过程,再采用SMRT技术测定其全长转录本序列,运用生物信息学对获得的原始转录组数据进行分析。结果显示：提取的总RNA符合建库要求;全长转录组测序共获得了包含5 914 711个亚读段(subreads)的14.0 Gb的数据,质量控制处理后包括236 130个全长非嵌合读段(reads)和97 626个一致性reads;转录本经去冗余处理后共获得61 057个全长一致性读段(unigenes),其中有54 099个被成功注释到7个数据库中,注释比达88.60%;对水杉unigenes作CDS(coding sequence)长度分布及转录因子分析,其CDS长度范围为144～6477 nt,平均长度约为679 nt;共检测到2386个转录因子,这些转录因子可以归类为29个家族。     

中华蜜蜂酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶相关基因 及其全长转录本发掘与分析

为深入开展中华蜜蜂相关研究提供参考信息和基础,利用已获得的纳米孔(Nanopore)测序数据对中华蜜蜂Apis cerana cerana的酚氧化酶(phenoloxidase, PO)和丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)相关基因和全长转录本进行发掘和分析。通过Blast工具将中华蜜蜂所有全长转录本比对KEGG和Nr数据库以筛选出PO和SP相关基因和全长转录本。采用gffcompare软件将PO和SP相关全长转录本与东方蜜蜂参考基因组(ACSNU-2. 0)已注释基因进行比较以优化结构。使用Astalavista软件鉴定PO和SP相关基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件,再利用IGV浏览器进行结构可视化。通过PCR验证AS事件的真实性。利用TAPIS pipeline预测和分析可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)位点,并通过TBtool软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因与146条转录本。优化了16个参考基因组已注释PO和SP相关基因的结构,其中5′端延长和3′端延长的基因均有7个,5′端和3′端同时延长的基因有2个。鉴定到PO和SP相关的10个基因的389次AS事件,其中最丰富的AS类型是5′端可变剪接。PCR结果证实了2次AS事件的真实性。共鉴定到34个PO和SP相关基因含有1个及以上的APA位点,其中含有3个APA位点的基因数量最多;在APA位点上游鉴定到多个motif,一致性序列为：GGHKSYWSHHTRATWTCNBHDMRRYWYRTNYTVACNGCKGCDCAYTGYR。鉴定到中华蜜蜂PO和SP相关的42个基因和146条全长转录本,优化了东方蜜蜂参考基因组已注释的PO和SP相关基因结构,并发掘出PO和SP相关基因的389次AS事件和237个APA位点。     

中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析

【目的】系统鉴定和分析中华蜜蜂(Apis cerana cerana)吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础。【方法】基于前期已获得的高质量中华蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过Blast工具将全长转录本比对Nr数据库筛选出吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本。利用gffcompare软件将全长转录本与东方蜜蜂(Apis cerana)参考基因组上注释的转录本进行比较,鉴定未注释的新基因和新转录本。利用TAPIS pipeline预测和分析吞噬与包囊作用相关基因的可变多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation,APA)位点,并通过TBtools软件鉴定APA位点上游的基序(motif)。使用Astalavista软件鉴定可变剪接(alternative splicing,AS)事件,并通过IGV浏览器进行结构可视化。通过RT-PCR验证AS事件的真实性。【结果】共鉴定到中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关的基因66个和全长转录本395条,发掘出东方蜜蜂参考基因组未注释的2个新基因和303条新转录本。对参考基因组已注释的34个基因进行了结构优化,分别延伸了18个基因的5′端和12个基因的3′端,同时延长了4个基因的5′端和3′端。共鉴定到含有1个及以上APA位点的吞噬与包囊作用相关基因47个,其中多于5个APA位点的基因最多,为32个。在APA位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为：GRBGCNKSDAACAAYTRBGCBMRNGGBYAYTAYWCNVWNGG。共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的AS事件296次,其中包括131次可变3′端剪接(alternative 3′splice site,A3SS)、85次内含子保留(intron retention,IR)、70次可变5′端剪接(alternative 5′splice site,A5SS)和10次外显子跳跃(exon skipping, ES)。RT-PCR结果显示,扩增的目的片段大小符合预期,证实了随机选择的2次AS事件的真实性。【结论】系统鉴定了中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本以及AS事件和APA位点,优化了东方蜜蜂参考基因组注释的吞噬与包囊作用相关基因的结构。     

花椒茎尖节点转录组测序及基因注释

花椒茎枝有尖锐皮刺,在实际生产中增加采摘成本,并降低采摘效率。为培育品质优良的无刺品种,筛选皮刺分化的关键基因具有重要意义。使用二代高通量测序技术对花椒皮刺起始分化的茎尖节点组织转录组进行测序,使用生物学软件对原始数据进行拼装,最终获得45 057条转录本序列。使用比对工具将得到的转录本与Swiss-Prot,NR,Pfam,KEGG,KOG数据库比对后,80.34%的转录本序列至少被一个数据库注释。获取的大量的基因序列及注释信息为进一步探究花椒皮刺分化分子机理提供了良好的基础,为定位皮刺分化关键基因提供依据。