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在无RNase污染的环境下,提取柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子RNA,进而纯化mRNA,采用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和第二链,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用Phage Maker extract对以上连接产物进行体外包装,形成完整的噬菌体,并用该噬菌体转染大肠杆菌ER1647,进行文库容量测定和扩增。以扩增文库的DNA为模板,利用已知基因引物克隆E. tenella3-1E基因,并进行测序。结果表明,成功构建了E. tenella孢子化卵囊子孢子的cDNA文库,文库原始库容量约为4×106pfu/mL,插入片段约100~3000 bp,扩增得到特定的E. tenella3-1E基因,说明文库质量高、代表性强,为进一步从文库中筛选相关基因提供了有效的工具。 相似文献
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【目的】对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)H蛋白胞外区(tH)细胞膜受体进行鉴定,为PPRV致病机制的研究奠定基础。【方法】克隆PPRV H基因胞外区(tH),在毕赤酵母(Pichia pastoris)中进行真核表达,纯化后免疫家兔,获得兔抗PPRVtH蛋白特异性抗体;提取山羊外周血淋巴细胞膜蛋白,经SDS-PAGE检测后,湿转印法转印至NC膜,分别利用纯化的重组tH蛋白和PPRV进行病毒铺覆蛋白结合试验(VOPBA),对受体进行鉴定。【结果】成功克隆了1 653 bp的PPRV tH基因,构建其重组酵母表达质粒pPIC9K-tH,诱导表达后获得了60 ku目的蛋白。重组tH蛋白免疫家兔后获得了效价为1∶200的抗血清。Westernblotting分析发现,该重组蛋白可与PPRV多克隆抗体发生特异性反应,山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上有2个与PPRV和重组tH蛋白结合的蛋白带,分子质量约为38和100 ku。【结论】从山羊外周血淋巴细胞膜蛋白上鉴定到了2种与PPRV结合的蛋白组分,其特性有待于进一步研究。 相似文献
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为鉴定兔豆状囊尾蚴(C.pisiformis)合适的诊断或免疫用抗原,本研究根据带科其他种属绦虫14ku基因的保守区设计引物,利用RT-PCR从C.pisiformis总RNA中成功扩增出长度为261bp的基因片段,命名为Tp14,预测其编码87个氨基酸。对其核苷酸同源性分析表明,该基因序列与泡状带绦虫、细粒棘球蚴、猪带绦虫基因序列的相似性均大于85%,处于同一进化分支上,表明该基因具有种属特异性;同时通过生物信息学软件对其蛋白二级结构、疏水性及抗原表位等方面的预测,认为其有望成为诊断或免疫用抗原。 相似文献
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【目的】探讨原核表达的柔嫩艾美耳球虫杨凌株3-1E蛋白的生物学活性。【方法】将含有3-1E基因的pGEX-3-1E重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行表达并对表达条件进行优化,表达产物纯化后进行Western-blot-ting分析。【结果】表达的3-1E重组蛋白相对分子质量为44.7 ku,与推导结果一致。在28℃、IPTG诱导浓度为0.5mmol/L的条件下诱导6 h,可溶性3-1E重组蛋白表达量最高。Western-blotting结果表明,3-1E重组蛋白可与兔抗鸡E.tenellaYL阳性血清发生反应。【结论】3-1E重组蛋白表达成功,表达产物具有免疫原性。 相似文献
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