基因组DNA的提取及RAPD条件优化

提取了木奈基因组 DNA,并以其为模板对影响 RAPD扩增的重要参数进行优化试验 ,以期建立木奈 RAPD反应的优化体系 .结果表明 ,PCR扩增体系最佳条件是 :2 0 μL体积中 ,2 0 0 μmol·L- 1 d NTP、2 .5 mmol· L- 1 Mg Cl2 、0 .2 μmol· L- 1随机引物、2 5 .0 ng·μL- 1 DNA模板、1 -2 U Tag酶     

均匀设计优化猕猴桃SRAP体系

采用均匀设计对影响猕猴桃SRAP-PCR体系的5种因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)进行5因素5水平和5因素3水平的两轮优化,建立猕猴桃SRAP-PCR的最佳体系(25μL):Mg2+2.50 mmol·L-1,dNTPs 0.25 mmol·L-1,引物0.2μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.25 U,模板DNA 150 ng.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸1 min,33个循环,72℃延伸10 min.     

黄瓜RAPD体系的优化与应用

以黄瓜为实验材料,采用改良CTAB法提取黄瓜基因组DNA进行RAPD分析,优化黄瓜RAPD体系的程序、模板、引物、dNTPs、Mg2+等参数。结果表明:黄瓜的PCR程序为94℃预变性3min;94℃变性30s,37℃复性30s,72℃延伸2min,循环40周,最后72℃延伸7min为佳;反应体系中,模板DNA的适宜浓度为2.5～5ng·μl-1,适宜的引物浓度为0.6μmol·L-1,dNTPs的适宜浓度为0.25mmol·L-1,Mg2+适宜浓度为1.875mmol·L-1。同时应用这一DNA扩增体系,进行黄瓜RAPD分析,筛选出了适用于申绿64的2条引物,最终得到了它的特异性条带。     

濒危竹种小蓬竹（Drepanostachyum luodianense） RAPD PCR反应体系优化

为了建立小蓬竹（Drepanostachyum luodianense） RAPD PCR反应的最优体系,以小蓬竹基因组DNA为模板,对影响其RAPD扩增的dNTPs浓度、模板DNA浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、Mg2+浓度等重要参数进行了单因子和正交试验。试验得出小蓬竹RAPD最优反应体系为: 20 μL反应体系,10×PCR buffer为1/10体积,dNTPs为100 μmol·L-1,模板DNA量为30 ng,Taq DNA聚合酶为10 U,引物浓度为02 μmol·L-1,Mg2+浓度为15 mmol·L-1。优化后的RAPD PCR反应程序为: 94℃预变性5 min,然后进入35个循环,即94℃变性1 min,35℃退火30 s,72℃延伸90 s,循环完毕后于72℃延伸7 min,最后在4℃保持。     

大血藤RAPD条件的优化

在进行大血藤遗传多样分析时,首先要建立大血藤RAPD反应优化体系,有必要就反应条件进行探索。以改进SDS法抽提藤本药用植物大血藤叶片总DNA,进行随机扩增多态DNA(RAPD)分析,分别测试了镁离子、dNTP、模板DNA含量、引物浓度、DNA聚合酶量和牛血清白蛋白浓度对反应结果的影响。通过各因子的组合研究,得出大血藤RAPD分析较适宜的扩增条件是:15μLPCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液(10mmol·L-1Tris·HClpH9 0,50mmol·L-1KCl,0 1%TritonX 100,1 5mmol·L-1MgCl2);25 01×10-9mol·s-1Taq酶(上海华美公司);10ng模板DNA;15pmol引物(上海Sangon公司);2g·L-1BSA;dATP,dCTP,dGTP和dTTP各0 15mmol·L-1。图4表2参8     

珍稀保护竹种筇竹SSR反应体系的优化

为建立高效的筇竹SSR反应体系,以筇竹新鲜幼嫩叶片提取的基因组DNA为模板,研究了影响SSR反应效果的因素,包括Taq酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA浓度等,建立了适合筇竹SSR反应的PCR体系,即20 μL反应体系中含有Taq酶0.8 U,Mg2+为1.5 mmol·L-1,dNTP 0.2 mmol·L-1,引物 0.25 μmol·L-1,模板DNA 60 ng.扩增程序为:94 ℃ 3 min,然后94 ℃ 40 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,30 个循环,72 ℃延伸5 min,4 ℃保存.     

葡萄基因组DNA的提取及RAPD条件优化

采用改良CTAB法提取葡萄属22种植物的基因组DNA,对其完整性进行了测定,通过单因素五水平试验,筛选模板、Mg2+、Taq酶、dNTPs和随机引物的浓度及其用量,建立了葡萄RAPD技术最优体系,即25 μL体积中模板DNA为40 ng·μL-1,MgCl２ 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.8 mmol·L-1,Taq DNA 聚合酶1 U·μL-1,引物 0.8 μmol·L-1,建立了葡萄基因组DNA的RAPD 反应扩增程序,即94℃预变性4 min, 94℃循环变性 45 s,37℃退火 55 s,72℃ 延伸 80 s,40个循环,最后72℃ 延伸10 min。     

白菜RAPD反应条件的优化

以芜菁、大白菜及其杂交 1代为试材 ,系统分析了 Mg Cl2 浓度、d NTP浓度、随机引物浓度、模板 DNA用量、Taq DNA聚合酶浓度以及不同来源扩增缓冲液对 RAPD反应的影响 ,建立了一套稳定的 RAPD反应体系。该体系反应体积为 2 0μL,Mg Cl2 浓度为 1 .5mmol/L ,d NTP浓度为 2 0 0μmol/L ,随机引物浓度为 0 .4μmol/L ,模板 DNA为 2 0 ng,TaqDNA聚合酶为 6.67μmol/( L· min)。在 8种热循环条件下 ,该体系具有稳定的重现性 ,其扩增程序为 :94℃ /1′→ 36℃ /2 0″→ 72℃ /1 0″预扩增 2循环 ;94℃ /1 0″→ 36℃ /1 5″→ 72℃ /70″扩增38循环 ;72℃ /4′延伸效果最好     

番茄微卫星标记(SSR)反应体系的优化研究

利用番茄材料研究了番茄SSR技术中PCR体系的主要成分对SSR扩增结果的影响,并比较了采用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明:番茄SSR的反应程序为94℃预变性2min;94℃变性30s,50℃复性30s,68℃延伸30s,35个循环;最后72℃延伸8min为佳。反应体系中,模板DNA的适宜浓度为20～40ng,适宜的引物浓度为0.4μmol·L-1,dNTP的适宜浓度为200μmol·L-1,Mg2+的最适浓度范围为2.0mmol·L-1,Taq聚合酶在15μL反应体系中宜加入0.65U。PCR产物检测时聚丙烯酰胺凝胶的分辨率显著高于琼脂糖电泳。     

果梅SSR反应体系的优化

以果梅品种小叶猪肝为试材 ,研究了果梅SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响 ,并比较了采用聚丙稀酰胺凝胶及琼脂糖电泳检测扩增产物多态性的差异。结果表明 :在PCR反应体系中 ,Mg2 + 的最适浓度范围为1 89～ 2 83mmol·L-1;dNTP最适浓度为 0 2 4mmol·L-1;引物的最适浓度为 0 38μmol·L-1;Taq 聚合酶在 2 6 5 μL反应体系中宜加入 1U。利用此反应体系 ,对 2 4个果梅代表品种进行了SSR反应 ,用 8%的非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳检测 ,扩增产物在 10 0～ 2 0 0bp之间 ,不同品种间DNA谱带多态性丰富。琼脂糖电泳检测的DNA多态性不如聚丙稀酰胺凝胶丰富     

黄藤ISSR反应体系的条件优化

在利用ISSR技术对黄藤进行分子生物学研究过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素,如模板DNA浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度以及退火温度等指标进行筛选和优化,获得用于黄藤ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μLPCR反应体积中含有1×缓冲液,20 ng模板DNA,2 mmol.L-1MgC l2,100μmol.L-1dNTP,1.5 U TaqDNA聚合酶,0.4μmol.L-1引物,2%甲酰胺,0.5 mmol.L-1亚精胺.扩增程序为:94℃预变性5 m in;再35个循环:94℃30 s,52℃45 s和72℃1.5 m in;最后72℃延伸7 m in.     

天麻PCR反应体系的建立

 通过对Mg²⁺,dNTP,随机引物、模板DNA,TaqDNA聚合酶浓度等反应参数的系统研究,建立了天麻RAPD分析体系。该体系反应总体积20 μL, 其中MgCl₂ 2.5 mmol/L, dNTP 0.25 mmol/L,模板20 ng,随机引物0.3 μmol/L,Taq酶1.5 U. 反应程序为94 ℃预变性5 min,94 ℃变性35 s,36 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,40个循环,最后72 ℃延伸5 min. 结果表明该体系具有良好的稳定性和重复性,可应用于天麻的演化、系统分类、品种鉴定等研究。     

福建含笑ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以福建含笑叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于福建含笑ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μL PCR反应体积中含0.4 mmol.L-1dNTPs,2.5 mmol.L-1Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,0.6μmol.μL-1引物,30 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,47.3℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸7 min,4℃保存。应用ISSR体系对5份福建含笑种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

常绿阔叶林优势种福建青冈RAPD反应体系的建立

以福建青冈幼叶为材料,利用改进的CTAB法提取福建青冈幼叶的总DNA,探索适合于随机扩增多态DNA标记(RAPD)扩增的反应体系.结果表明,福建青冈合适的RAPD反应体系为:反应体积15μL,含10 ng模板DNA、1.5 mmo.lL-1MgC l2、0.3μmol.L-1引物、0.3 mmo.lL-1dNTP、1 UTaqDNA聚合酶.扩增程序为:94℃预变性3 m in,然后于94℃变性30 s,37℃复性30 s,72℃延伸90 s,循环41次,最后于72℃延伸7 m in.应用上述反应体系进行福建青冈的RAPD扩增反应,扩增产物进行12 g.L-1琼脂糖凝胶电泳,EB染色后用紫外凝胶成像系统分析,可获得满意的指纹图谱.     

荷花ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR-PCR分析的最适宜的PCR反应体系:20μL PCR反应体积含0.4 mmol.L-1dNTPs、3.5 mmol.L-1Mg2+、1.5 UTaqDNA聚合酶、0.4μmol.μL-1引物、3 ng模板DNA。PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,54.5℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,最后72℃延伸7 min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

甘薯品种鉴定中指纹图谱的建立和应用

应用RAPD分析技术体系,构建了甘薯品种的指纹图谱.结果表明,在20μLPCR反应体积中,含有10mmol·L-1Tris-HCl(pH8.3)、50mmol·L-1KCl、2.5mmol·L-1MgCl2、100μmol·L-1dNTP、0.3μmol·L-1引物、40ng模板、1.5UTaq酶的反应体系适合甘薯RAPD分析.利用上述甘薯RAPD分析的指纹图谱,鉴定了10个供试品种.     

苦楝RAPD反应体系的优化

以苦楝叶片提取的基因组DNA为材料,通过单因素多水平梯度试验,筛选DNA模板,Mg^2＋,Taq DNA聚合酶,dNTPs和随机引物的浓度及用量,建立苦楝RAPD技术分析体系.结果表明：当基因组DNA浓度为60 ng/μL,镁离子浓度为3.0 mmol/L,dNTP浓度为0.25 mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1 U/20μL,反应体系总体积20μL时,出现可辨认的清晰谱带.其扩增程序为：94℃预变性2 m in;然后38个循环（94℃变性30 s,37℃退火1 min,72℃延伸80 s）;最后72℃延伸8 min,4℃保存.     

九节茶ISSR反应体系的建立及优化

以九节茶叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,诸如dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量、退火温度以及循环次数等指标进行筛选和优化.结果表明:20μL ISSR反应体系含10×PCR Buffer、0.4 mmol.L-1dNTPs、2 UTaqDNA聚合酶、0.6μmol.μL-1引物、5 ng模板DNA;PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,44.8℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环,最后于72℃延伸7 min,置4℃保存.应用该ISSR体系对10份九节茶种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

假臭草DNA提取及RAPD反应体系的优化

以假臭草叶片为材料,对影响其随机扩增多态DNA（RAPD）反应的各因素进行优化．建立了假臭草RAPD的优化反应体系和程序,即在10μL反应体系中,5ng（／10μL）模板DNA,1．0μmol／L随机引物F15,150μmol／LdNTPs,2．0mmol／LMg^2＋,1．0UTaqDNA聚合酶;扩增程序为95℃预变性4min,95℃变性40S,36℃退火40S,72℃延伸1min,10个循环,后94℃变性30s,35℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸5min,4℃保温。     

大字杜鹃RAPD反应体系的优化

以大字杜鹃为材料,以改进的CTAB法提取大字杜鹃叶片总DNA,分别就模板DNA浓度,引物浓度,DNTP浓度,TaqDNA聚合酶量及镁离子浓度对大字杜鹃RAPD反应结果的影响进行研究．通过对各因子的组合比较,建立了大字杜鹃RAPD反应的优化体系,即总反应体积为25pL,其中包括10×Taq酶配套缓冲液2．5pL,模板DNA浓度50mg／L,引物浓度0．5μmol／L,dNTP浓度0．15mmol／L,TaqDNA聚合酶1U,Mg^2＋浓度2．0mmol／L,其余用重蒸馏水补足．扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性1min,38℃退火40S,72℃延伸2min,共41个循环,72℃延伸7min．