蚯蚓蛋白酶解工艺及其产物分析

采用Asl.398枯草蛋白酶制备蚯蚓肽,通过单因素与正交试验设计(L9(34)),以氨基氮数,多肽浓度为衡量指标,对最佳酶条件进行筛选研究,并分析了酶解液氨基酸含量和相对分子量的分布。结果表明:最佳酶解条件为pH 6.5、酶浓度为1%、温度50℃反应、时间8 h,在此条件下,酶解蚯蚓蛋白的水解液氨基氮数可以达到16.55 mmol/100 mL,水解液多肽浓度达9.22 mg/mL,酶解液分子量大部分是在5 000以下的多肽、小肽及氨基酸的混合物,其中分子量在220以下的占了72.09%,氨基酸组成平衡,含量丰富,可用来制取新型氨基酸微量元素及小肽添加剂。     

蚯蚓蛋白酶解工艺及其产物分析

采用Asl.398枯草蛋白酶制备蚯蚓肽,通过单因素与正交试验设计(L9(34)),以氨基氮数,多肽浓度为衡量指标,对最佳酶条件进行筛选研究,并分析了酶解液氨基酸含量和相对分子量的分布。结果表明:最佳酶解条件为pH 6.5、酶浓度为1%、温度50℃反应、时间8 h,在此条件下,酶解蚯蚓蛋白的水解液氨基氮数可以达到16.55 mmol/100 mL,水解液多肽浓度达9.22 mg/mL,酶解液分子量大部分是在5 000以下的多肽、小肽及氨基酸的混合物,其中分子量在220以下的占了72.09%,氨基酸组成平衡,含量丰富,可用来制取新型氨基酸微量元素及小肽添加剂。     

不同蛋白酶酶解产物活性大豆肽分子量分布状态的研究

研究不同蛋白酶的酶解产物活性大豆肽的分子量分布状态.用6种单一酶和6种复合酶对大豆分离蛋白进行酶解,采用高效液相色谱分析,计算分子量,界定出分子量分布范围.据此考核大豆肽含量及分子量分布状态,判定不同蛋白酶的水解效果.结果表明,6种单一蛋白酶水解生成的蛋白和肽分子量范围差异很大,大豆蛋白改性酶水解效果最好,酶解后分子量分布范围在6 441～144 Dalton之间,MW≤1 000 Dalton的组分占97.42%,符合肽的标准.6种复合蛋白酶水解生成的蛋白和肤分子量范围差异也很大,以大豆蛋白改性酶与蛋白液化剂组合最好,其分子量范围在4 560～141 Dalton之间,MW≤1 000 Dalton的组分占99.52 %.     

螺旋藻小分子多肽制备工艺的研究

碱性蛋白酶水解螺旋藻蛋白制备多肽粗品。根据中心组合试验设计原理,在单因素试验的基础上,以水解度为响应值,利用响应面法对影响螺旋藻蛋白水解的各种影响因素如温度、pH、酶解时间和加酶量进行了系统研究,得到最佳工艺条件为：pH值7.0、反应温度55℃、酶解时间160 min、酶底比4 300 U/g,水解度可达到26.8%。超滤截取相对分子量小于5 kD以下的组分,冷冻干燥后过SephadexG-25凝胶柱层析收集螺旋藻小分子肽段。根据标准蛋白色谱层析检测所得制品为相对分子量在307～1 450 D范围的螺旋藻小分子肽段。     

超滤在猪血红蛋白酶解液中的应用研究

采用6～10 kD和3 kD超滤膜对猪血红蛋白水解液进行浓缩实验,对超滤前后的多肽类蛋白质、氨基氮、血红素的变化进行分析.实验结果表明:采用3 kD超滤膜对酶解液的浓缩效果较好,浓缩倍数分别达到2.3、2.0、1.9,经冷冻干燥得产物蛋白质多肽含量91%,血红素含量2.9%混合营养物,可以用来制备含量较高的富含血红素肽的混合营养物.     

碱性蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物抗氧化特性研究

采用碱性蛋白酶对核桃粕蛋白进行酶解,测定了不同酶解时间下的酶解液抗氧化性;用葡聚糖凝胶分离活性肽段并测定其抗氧化性。结果表明,酶解条件为酶用量3 000 U/g底物、底物质量浓度为40mg/mL、pH为8.5、温度为50℃下酶解210 min,酶解液的抗氧化活性较高,OH.清除率为72.3%,氧自由基清除率为83.1%,DPPH.清除率为102.6%,总抗氧化能力为162.986 U/mL;通过葡聚糖凝胶分离并与已知标准品对照表明碱性蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物抗氧化活性多肽的分子量主要集中在1 321~607 u,该多肽片段对OH.清除率为70.23%,氧自由基清除率为62.57%,DPPH.清除率为99.56%,总抗氧化能力为118.987 U/mL。     

响应面优化南极磷虾粉肽制备工艺及α-葡萄糖苷酶抑制活性分析

该研究以南极磷虾粉为原料,α-葡萄糖苷酶抑制率为指标,在确认最佳生物酶的基础上,通过单因素实验和响应面优化酶解工艺条件,并用超滤和G-25进行分离纯化,凝胶色谱法探究酶解液和多肽的分子量及其分布情况。结果表明：复合蛋白酶酶解效果最佳;最佳酶解条件为酶解时间5.9 h、料液比3.75:1、酶添加量0.062 g/g(原料);酶解液的分子量集中分布在3000 u以下,占98.63%;经超滤C4（<3 ku）组分对α-葡萄糖苷酶抑制率IC50为（14.89±2.15） mg/mL;G-25纯化C4-2组分对α-葡萄糖苷酶抑制率IC50为（4.64±0.15） mg/mL。C4-2组分中<1000 u的多肽占97.6%,其中C4-2-1、C4-2-2、C4-2-3的分子量分别为597 u、335 u、246 u。本文第一次研究了南极磷虾粉制备α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法,为南极磷虾资源的综合利用提供了依据。     

豆粕蛋白酶解过程中呈味物质的释放规律

探讨了不同酶解条件对豆粕酶解过程中呈味物质释放规律的影响.结果表明,酶解液中肽态氮的含量随着酶解温度、酶解pH、酶解时间的增加均呈现先增加后降低的趋势.总酸含量的变化受酶解条件的影响较大,酶解3h时糖的释放量最大.高效液相色谱分析结果表明,酶解液中的肽分子量在酶解过程中逐渐降低.氨基酸分析结果显示,酶解后,游离氨基酸和肽态氨基酸含量迅速增加.当酶解工艺为温度50℃、pH=6.5、时间4h时,所得酶解液整体味感较佳,适于做调味基料.     

套膜海葵总蛋白的提取和酶解条件优化及其杀虫活性

【目的】明确套膜海葵总蛋白的提取工艺、最优酶解条件及其杀虫活性,为拓展和开发海葵酶解多肽的应用提供理论依据。【方法】采用裂解液法提取海葵总蛋白,结合单因素试验对其酶解条件进行优化;同时采用昆虫注射法研究酶解海葵多肽的杀虫活性。【结果】从套膜海葵中提取海葵总蛋白的分子量主要为31.0～43.0kDa,20g套膜海葵可提取海葵总蛋白160mg,蛋白浓度为0.5mg/mL;海葵总蛋白的最优酶解条件为pH 8、碱性蛋白酶(最佳水解酶)4 000U/g、温度60℃、酶解6h,在此条件下酶解得率为9.145%;昆虫注射海葵酶解多肽1.0μg/mg时死亡率达90%。【结论】获得海葵总蛋白酶解的最佳蛋白酶及其最优酶解条件,成功制备具有杀虫活性的海葵酶解多肽,为深入开发海葵酶解多肽的杀虫活性奠定了基础。     

酶法制备大豆蛋白成骨活性肽

【目的】探究从大豆分离蛋白双酶分步酶解产物中分离促成骨细胞增殖肽的工艺,为大豆产品的开发提供参考。【方法】以促成骨细胞增殖活性作为测定指标,选用木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白（SPI）,采用MTT法检测不同浓度的木瓜蛋白酶酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。采用pH-Stat法检测水解时间为1、2、3、4、5和6 h的木瓜蛋白酶酶解产物的水解度,并检测相应水解时间的酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。然后分别采用截留分子量为30 kD和10 kD两种超滤膜对活性较高的酶解产物进行超滤,并测定各超滤组分对成骨细胞的促增殖活性。再将具有较高促成骨细胞增殖活性的超滤组分分别在0.5、1、1.5、2和2.5 h进行碱性蛋白酶酶解,并检测相应水解时间的酶解产物对成骨细胞的促增殖活性。然后选用交联葡聚糖（Sephadex G-15）对具有较高促成骨细胞增殖活性的酶解产物进行分离,并检测各分离组分对成骨细胞的促增殖活性。最后,对各分离组分进行氨基酸分析,并采用质谱（ESI-TOF MS/MS）对最高促成骨细胞增殖活性的分离组分进行结构鉴定,并筛选出具有较强促成骨细胞增殖的大豆活性肽。【结果】在浓度为200 μg·mL ^-1时,木瓜蛋白酶酶解物对成骨细胞的促增殖活性随着酶解时间的增加逐渐增强,当酶解时间为5 h时达到最高促增殖活性（（118.24±2.73）%）。木瓜蛋白酶酶解产物经超滤分离、碱性蛋白酶酶解和凝胶过滤色谱分离后,对各分离组分进行氨基酸分析并筛选得到对成骨细胞具有最强增殖活性的组分F3,该组分的成骨细胞增殖率为（125.80±2.94）%,且F3中丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等疏水性氨基酸以及芳香族氨基酸和必需氨基酸的含量明显高于其他组分。进一步通过质谱鉴定出F3主要由10个肽段组成。其中,DAMDGWFRL、GQTPLFPR、ADFYNPK、KDWYDIK的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸以及必需氨基酸占比较高。对上述4个肽段进行活性测定,发现GQTPLFPR的促成骨细胞增殖活性最强,在浓度为100 μmol·L^-1时,其成骨细胞增殖率为（129.11±3.12）%。【结论】采用双酶分步酶解结合超滤和凝胶过滤色谱等蛋白分离纯化技术,从大豆分离蛋白中分离纯化出了具有较强促成骨细胞增殖活性的多肽,为促成骨细胞增殖活性肽的制备和应用提供了技术参考。     

胰蛋白酶制备乌贼缠卵腺抗氧化活性多肽的研究

[目的]探讨胰蛋白酶制备乌贼缠卵腺抗氧化活性多肽的工艺及体外抗氧化活性.[方法]以乌贼缠卵腺为原料,用胰蛋白酶进行酶解,采用单因素和正交试验优化乌贼缠卵腺抗氧化活性肽的提取工艺;将酶解液超滤分成4个分子段,通过体外检测DPPH清除率、·OH清除率和还原力评价其抗氧化活性.[结果]胰蛋白酶酶解乌贼缠卵腺在加酶量2000 U/g、pH为8.5、料液比1:3、酶解时间8 h条件下得到的酶解物对DPPH的清除率最大.酶解液经超滤得到的<3 kD分子段的多肽具有良好的DPPH清除能力、·OH清除能力和还原能力.[结论]胰蛋白酶酶解制备的乌贼缠卵腺多肽具有较好的体外抗氧化活性,可作为抗氧化肽的理想来源.     

抗肿瘤活性青蛤多肽的提取工艺研究

[目的]探究具有抗肿瘤活性的青蛤多肽的最佳提取工艺路线.[方法]选择胰蛋白酶酶解青蛤,以酶解液对PC-3细胞增殖抑制率（IR）为指标,研究料液比、温度、pH、加酶量和酶解时间对多肽提取率的影响,探讨最佳工艺,并采用超滤及G25洗脱分离纯化提取液.[结果]当温度为45℃、pH为7.0、料液比为1∶3、酶解时间为6h、加酶量为300 U/g时,分子量为3～5 kD青蛤提取液的抗肿瘤活性最好;分离纯化后在280 nm波长处得到3个峰,其中峰1和峰2成分抗肿瘤活性显著.[结论]以细胞增殖抑制率为指标可以确定青蛤多肽的提取及优化工艺路线.     

鹿茸胶原多肽复合酶水解工艺研究

【目的】对鹿茸胶原多肽进行复合酶水解,优化水解工艺,并测定水解液分子量分布。【方法】以碱性蛋白酶和胰蛋白酶为供试酶类,选用酶解时间、pH值、酶解温度、加酶量为影响因素,采用响应面试验设计优化单酶水解条件,根据响应面试验所得到的单酶水解的最适条件,确定双酶复合水解方案。通过Sephadex G25测定鹿茸胶原多肽的分子量分布。【结果】碱性蛋白酶最优水解条件为:酶解时间3.6h,pH值10.50,酶解温度55℃,加酶量4%,水解液的水解度为22.03%;胰蛋白酶最优水解条件为:酶解时间3.2h,pH值8.00,酶解温度50℃,加酶量4.4%,水解液的水解度为15.81%。复合酶水解条件:酶解温度为52.5℃,调节pH值为10.50,加入4%的碱性蛋白酶酶解3.6h;调节pH值至8.00,加入4.4%的胰蛋白酶酶解3.2h,所得水解液的水解度可达33.42%。复合酶水解胶原多肽的分子量分布在400~1 400u。【结论】确定了鹿茸胶原多肽碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合水解的工艺条件。     

乌贼内脏酶解多肽的制备和抗氧化活性研究

[目的]探讨乌贼内脏酶解多肽的制备和抗氧化活性。[方法]以乌贼内脏为原料,用胰蛋白酶对其进行水解,采用单因素和正交试验方法研究酶解温度、酶解时间、加酶量和pH对水解度和抗氧化性的影响;通过检测羟自由基清除率、DPPH清除率和还原力评价不同分子量水解物多肽的抗氧化性。[结果]当酶解温度为35℃,时间为5 h,加酶量为5 000 U/g,pH为7.5时,水解度最大;当酶解温度为40℃、时间为7 h、加酶量为4 500 U/g,pH为8.0时,水解物对羟自由基清除率最大。超滤后不同分子量多肽对羟自由基的清除率为3～5 kD3 kD以下5～10 kD;DPPH清除率:3～5 kD3 kD以下5～10 kD;还原力:3 kD以下3～5 kD5～10 kD。[结论]乌贼内脏酶解多肽具有较好的抗氧化活性,不同分子量多肽的活性不同。     

紫贻贝酶解多肽体外抗肿瘤活性研究

确定了紫贻贝胰蛋白酶水解时的最佳条件,研究了紫贻贝酶解多肽的体外抗肿瘤活性。采用正交实验方法,以料液比、pH、加酶量、酶解温度和酶解时间为因素,以酶解液的氨基氮含量和肿瘤细胞增殖抑制率为指标进行L16（45）正交实验,MTT法检测酶解多肽对DU-145、PC-3、H1299和MGC80-3等肿瘤细胞的抑制活性;HE染色法观察酶解多肽对肿瘤细胞形态的影响;免疫组化法检测酶解多肽对细胞中Bcl-2表达的影响。结果表明：当料液比为1：4、pH为8.5、加酶量为1 000 U/g、温度为45℃、酶解时间为5 h时酶解多肽的水解度最大;当料液比为1：4、pH为8.0、加酶量为1 500 U/g、温度为40℃、酶解时间为2 h时酶解多肽的抗肿瘤活性最强,该肽可以下调肿瘤细胞中Bcl-2的表达。紫贻贝酶解多肽具有抗肿瘤活性,可能是通过诱导细胞凋亡来实现的。     

双酶水解黄粉虫蛋白制备生物活性肽的工艺优化

【目的】对胰蛋白酶与碱性蛋白酶Alcalase双酶组合水解黄粉虫蛋白制备生物活性肽的工艺进行优化,为获得高活性黄粉虫蛋白多肽及有效利用黄粉虫蛋白提供科学依据。【方法】以水解度和酸溶性肽得率为指标,研究了酶解时间、酶活比、料液比、加酶量、pH和酶解温度6种因素对酶解反应的影响。在此基础上设计了3因素(加酶量、pH和酶解温度)3水平的响应面试验。【结果】胰蛋白酶与碱性蛋白酶Alcalase双酶水解黄粉虫蛋白的最佳酶解条件为:酶解时间120 min,酶活比1∶1,料液比1∶3,加酶量23.41 mg/g,pH 8.77,酶解温度53.41℃。【结论】利用优化双酶水解条件制得的低分子多肽的水解度高达21.61%,酸溶性肽得率为92.09%。     

蝇蛆抗氧化肽的制备及其纯化

以DPPH自由基清除率为评价指标,通过单因素试验和正交试验优化碱性蛋白酶水解蝇蛆蛋白制备抗氧化肽的工艺条件。采用超滤、Sephadex G25凝胶过滤层析对蝇蛆蛋白水解物进行分离纯化,筛选高抗氧化活性组分。结果表明,酶法制备蝇蛆蛋白抗氧化肽的最佳工艺条件为:加酶量7000 U/g,底物质量浓度1%,酶解时间15 min,酶解温度50℃,p H值7.5。水解物经超滤得到相对分子量大于10 k D、5~10 k D以及小于5 k D的组分,以小于5 k D组分清除DPPH自由基活性最强。该组分通过凝胶过滤层析进一步分离得到2个组分,其中组分Ⅱ的清除DPPH活性明显高于组分Ⅰ,达到81.83±0.80%。酶解产物经2步纯化后,其DPPH清除活性得到了显著提高,提高约57.88%。     

乳酪蛋白肽制备工艺的优化

[目的]研究制备乳酪蛋白肽的最佳工艺.[方法]以乳酪蛋白为原料,以水解度为考察指标,确定碱性蛋白酶为乳酪蛋白的最佳水解酶.利用单因素试验考察酶解温度、pH、投酶量、酶解时间和底物浓度对水解度的影响,确定主要影响因素.通过L9(34)正交试验获得碱性蛋白酶的最佳水解条件.利用凝胶色谱法确定乳酪蛋白肽的分子量.[结果]试验得出制备乳酪蛋白肽的最佳工艺为:酶解温度60℃,pH 7.0,投酶量1.5％,酶解时间150 min.制备的乳酪蛋白肽分子量为2 kD.[结论]研究可为乳酪蛋白活性肽的产业化研发提供理论依据.     

中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽的研究

【目的】为了充分利用花生榨油之后的副产物,提高产品附加值,建立花生短肽制备工艺,研发功能性花生短肽产品。【方法】通过比较酶种类、底物浓度、酶解温度、酶解时间对水解度与短肽得率的影响,采用二次回归正交旋转组合设计优化分步酶解制备花生短肽的最佳工艺。【结果】中性蛋白酶分步酶解花生分离蛋白制备短肽的最佳工艺参数为：Neutrase水解花生分离蛋白2.04 h后加入Protamex继续酶解1.96 h,Neutrase添加量为5 200 U•g-1底物,Protamex添加量为422.32 U•g-1 底物,水解温度44.83℃,底物浓度8%,在此条件下,短肽得率为83.93%,水解度为38.25%,花生短肽纯度为93.85%±0.44%。经高效液相色谱测定,分子量小于1 000 D的水解产物占98.88%。【结论】采用Neutrase与Protamex分步酶解花生分离蛋白制备花生短肽,与现有碱性蛋白酶酶解制备花生短肽方法相比,避免了后续脱盐步骤,简化了工艺,且具有制备条件温和,DH和TCA-NSI高,纯度高,分子量集中分布于1 000 D以下等特点。     

The Technology Research of Anti-oxidation Peptide Preparation by Alkaline Protease Hydrolyzing Wheat Germ Meal

小麦胚芽粕是小麦胚芽提油后的副产物,大部分未得到充分开发利用,因此有大量的小麦胚芽蛋白损失。为了充分开发利用小麦胚芽粕蛋白,对其进行了碱性蛋白酶酶解备抗氧化肽。通过单因素实验和回归分析,得到最优实验条件为加酶量0.8%（w/w）,料水比1：12.3,酶解时间2.1 h,此条件下得到 DPPH清除率为49.78%,水解度为22%,水解液中肽含量为1.9%（w/w）.通过SDS-PAGE电泳,肽的分子量都在10 ku以下,大部分在4.54和5.63 ku之间。小麦胚芽蛋白得到充分利用从而节约了粮食。