肉种鸡马立克氏病的动态病理组织学研究

通过人工感染马立克氏病病毒强毒株的1日龄肉种鸡,定期剖检,进行病理组织学和肿瘤组织的超微结构观察,为目前复杂的禽肿瘤性疾病混合感染鉴别诊断及早期诊断提供病理学依据。结果表明,光镜下,感染后1周各组织器官主要为炎性变化或变化不明显;2周时,部分器官发现一种胞体较大,胞浆强嗜碱性,其细胞核只有极少或无详细结构的马立克氏病细胞,大部分组织器官淋巴细胞、网状细胞增生,增生程度日益加重,大脑有血管套现象;7周时,肌胃内动脉首先出现粥样硬化,在10~13周时,大脑等相继出现该变化。电镜下,肝脏肿瘤组织有大小不同的淋巴细胞和马立克氏病病毒,并见淋巴细胞的凋亡和核分裂相。本实验通过动态病理学研究发现,马立克氏病细胞和动脉粥样硬化可作为MD肿瘤产生前早期诊断的依据。     

地方品种皖南黄肉种鸡ALV-J与REV的共感染 及其分子变异分析

 【目的】探讨地方品种皖南黄肉种鸡群中禽白血病病毒（ALV）与禽网状内皮增生病病毒（REV）的感染状态，同时对J亚型ALV（ALV-J）分离株的囊膜糖蛋白基因（env）和非编码区3′UTR序列进行分子变异分析，并对近十年的分离株非保守序列区段进行统计比较，探讨ALV-J分子变异趋势。【方法】取7只300日龄皖南黄肿瘤病鸡分别进行病理组织学观察、IFA检测肝脏组织切片后激光共聚焦观察、细胞培养后的IFA以及PCR方法检测。【结果】7只皖南黄肉种鸡有6只同时感染ALV-J与REV，而且ALV-J和REV已经共感染同一个肝细胞。取2个ALV-J分离株进行env基因与非编码区3′UTR扩增与序列分析，两分离株的env全长均为1 704 bp，3′UTR全长均为400 bp，3′UTR区段rTM和E元件同发生双缺失；3′UTR-E元件与近十年国内来自白羽肉鸡的ALV-J分离株比较，基因缺失表现为共性，但3′UTR-rTM基因缺失呈现多样性；5′LTR作为保守序列较之前所有国内外毒株有11 bp缺失。【结论】研究发现，地方品种皖南黄肉种鸡群存在ALV-J与REV的共感染，且呈现普遍性（6/7），表明地方品种鸡高肿瘤发生率与ALV-J、REV共感染密切相关；ALV-J的基因缺失主要集中于3′UTR-E与3′UTR-rTM， 3′UTR-E元件基因缺失显示，皖南黄肉种鸡群ALV-J分离株与近十年国内来自白羽肉鸡的ALV-J分离株有共同的来源。     

母源抗体对禽网状内皮增生病病毒感染诱发生长迟缓和免疫抑制的预防作用

【目的】确定经禽网状内皮增生病病毒（REV）细胞适应毒免疫的种鸡提供的母源抗体在雏鸡抗REV感染中的保护性免疫作用。【方法】分别对有母源抗体和无母源抗体的雏鸡人工感染REV野毒，比较它们的生长速度和对新城疫病毒（NDV）和禽流感病毒(AIV)灭活苗免疫后的抗体反应。【结果】在没有REV母源抗体的商品代肉鸡，1日龄感染REV不仅造成生长迟缓，还会显著抑制对NDV和AIV (H5和H9）疫苗的免疫反应。由致弱的REV疫苗免疫的父母代种鸡提供的母源抗体，不仅可预防REV野毒感染引起的生长迟缓，也可预防REV引起的对NDV和AIV灭活疫苗免疫反应的抑制作用。在1日龄攻毒REV后，有REV母源抗体组对所有三种灭活疫苗免疫后的抗体水平都显著高于无母源抗体组。免疫后4周，有母源抗体组和无母源抗体组对NDV、AIV-H9和AIV-H5的血凝抑制（HI）抗体滴度分别是3.36±2.04 vs 1.58±1.69(P＜0.01)，6.27±3.87 vs 0.71±1.60(P＜0.01)和6.72±3.92 vs 0.54±1.44(P＜0.01)。【结论】来自免疫种鸡的REV母源抗体不仅有效地预防雏鸡感染REV，而且有效地预防或减弱REV感染造成的生长迟缓及其对NDV和AIV灭活疫苗免疫后抗体反应的抑制作用。     

REV与ALV-J共感染对肉鸡T淋巴细胞免疫功能与组织病理学的影响

 【目的】研究致瘤性病毒REV、ALV-J单一感染和共感染肉鸡后血液和脾T淋巴细胞的免疫功能与脾组织病理学的变化。【方法】用一定剂量的REV和ALV-J单一感染及共感染1日龄肉鸡,取感染后不同日龄鸡的血液和脾组织,无菌分离淋巴细胞,用3H-TdR掺入法和MTT法分别检测T淋巴细胞增殖活性和细胞毒T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性,并对脾脏进行组织切片、H.E染色检测组织病理学变化,通过免疫荧光抗体结合试验(immunofluorescence assay,IFA)分析组织病毒感染量变化。【结果】感染REV和ALV-J的肉鸡血液和脾T淋巴细胞的增值活性和CTL杀伤活性在整个感染监测期出现降低,单一感染比,共感染两种病毒的肉鸡在某些阶段出现T淋巴细胞免疫功能抑制加重;检测感染后17 d和37 d的脾脏组织病理学变化表明感染病毒的脾脏组织出现间质稀疏,淋巴细胞数量减少,生发层被破坏或减少,17 d较37 d出现病理变化更为明显;同时采用荧光标记的单克隆抗体进行IFA检测发现脾内淋巴细胞含有大量病毒粒子,在共感染两种病毒的肉鸡脾细胞内均检测出两种病毒,且含有病毒数量明显多于单一感染一种病毒的肉鸡。【结论】REV和ALV-J共感染后肉鸡T淋巴细胞功能抑制更为严重,这可能与两种病毒在肉鸡体内数量积聚增加、互为促进有重要关系;同时这两种病毒感染后造成T免疫细胞增殖活性和对肿瘤细胞的杀伤活性降低,可能是病毒持续感染、增殖及组织病变、产生肿瘤细胞的前提,本研究为家禽临床生产中防治REV和ALV-J感染提供免疫学基础。     

病毒 REV 与 ALV-J 经鸡胚垂直传播共感染对雏鸡的协同致病性

【目的】J 亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）和禽网状内皮组织增殖病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）均可通过鸡胚垂直传播，且两者在鸡胚中的自然共感染已有报道，但两者经鸡胚共感染的致病性未有研究。建立 ALV-J 与 REV 垂直传播共感染的实验动物模型，研究 ALV-J 与 REV垂直传播共感染的致病作用及其对禽白血病净化检测的影响，以期为推动多病原协同净化提供参考。【方法】通过鸡胚接种方式构建分别携带 ALV-J、REV 及两者共感染的雏鸡感染模型，通过孵化率、死亡率、体重、胎粪 ALV-p27 抗原检出率、病毒血症阳性率等指标分析 REV 与 ALV-J 在垂直传播中共感染的致病性。【结果】ALV-J+REV 共感染组鸡胚孵化率为 65.71%，低于单感染组和空白组（CK）；共感染组死亡率高于单感染组和CK。7 日龄时 CK、ALV-J 组、REV 组、ALV-J+REV 组雏鸡平均体重分别为 59.25、50.83、49.67、43.78 g，共感染加重了对雏鸡生长的抑制。ALV 血浆病毒分离结果显示，ALV-J 组、ALV-J+REV 组阳性率在各日龄均为100%，CK 均为 0%。采集肛拭子检测 ALV-p27 抗原结果显示，ALV-J+REV 组雏鸡阳性率在 1、3、7、14 日龄分别为 91.30%、94.12%、90.90% 和 100%，肛拭子的 ALV-J p27 阳性检出率低于血浆病毒分离。比较免疫器官发育指数结果显示，ALV-J 和 REV 单感染均导致雏鸡免疫器官萎缩，共感染加重免疫器官萎缩程度。免疫器官病毒载量显示，REV 与 ALV-J 共感染促进了 ALV-J 在免疫器官中的增殖，同时 ALV-J 也促进了 REV 在免疫器官中的增殖。【结论】相对于 ALV-J 和 REV 单感染，两者共感染降低了鸡胚孵化率、增加了雏鸡死亡率、增强了对雏鸡生长的抑制作用，对诱导胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官萎缩的影响更加显著，且两者在共感染过程中对彼此复制均有促进作用。     

鸡J亚群白血病病毒与网状内皮增殖病病毒混合感染发病机理的研究

通过人工感染建立了ALV—J、REV单独感染和混合感染1日龄肉仔鸡的病理模型。初步研究表明混合感染使试验鸡的生长发育障碍、免疫器官萎缩、对细菌易感性及死亡率等指标显著升高。 动态病理学研究表明：REV感染主要引起骨髓网状细胞及淋巴样细胞弥漫性或灶状浸润，ALV—J感染主要引起骨髓髓系细胞灶状或弥漫性显著增生，混合感染时骨髓病变与REV感染基本一致，但相对较严重，并见ALV—J感染病变。各病毒感染组免疫器官均发生了严重的实质萎缩性病变，病变以混合感染组最重，REV组次之。在某些组织器官ALV—J组见嗜酸性粒细胞样的瘤细胞浸润增生，REV组见网状细胞及淋巴细胞样瘤细胞浸润增生，而混合感染组见以上两种瘤细胞增生。从混合感染组的病变来看，在致病性上ALV—J与REV之间的确存在明显的协同促进作用，导致机体的免疫抑制加重，但混合感染早期尚未发现REV对ALV—J致瘤的促进作用。     

含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建及初步应用

【目的】为了构建MDV1细菌人工染色体，以便快速有效地进行重组病毒的筛选，进行了含E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体的构建。【方法】利用DNA重组技术，构建了含有E.coli F因子的马立克氏病病毒1型（MDV1）转移载体，利用脂质体，将线性化的转移载体转染入已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，用X-gal染色,挑取阳性克隆。【结果】经测序分析发现，人工体外合成的单一loxP位点，序列正确，另外，同源重组左臂和右臂序列正确，并且相对连接。利用SphⅠ和NheⅠ双酶切，鉴定出含有同向LoxP位点的转移载体，将其命名为pUS-BGS。将该载体用NheⅠ线性化后，用脂质体转染已感染CVI988病毒的CEF，用MX-HAT药物筛选3代以后，X-gal染色，可以观察到呈现蓝色的重组病毒。【结论】本研究报道了含有E.coli F因子以及两同向的loxP位点的MDV1转移载体的构建，利用该载体可以有效地进行重组病毒的筛选，为下一步MDV1细菌人工染色体的构建奠定了基础。     

马立克氏病鸡组织中PRNP基因表达量分析

【目的】探明PRNP基因表达量与鸡马立克氏病发病之间的关系.【方法】从甘肃省康乐县某养鸡场采集马立克(MD)病鸡组织样品,通过RT-PCR检测MDV致瘤相关基因Meq和pp38以及病理组织学观察将样品分为MD肿瘤病变鸡、MD无病变鸡与健康鸡,最后通过荧光定量PCR方法分析3组中PRNP基因mRNA水平的相对表达量的差异.【结果】MD无病变鸡中PRNP基因的表达规律与健康鸡基本一致,但与MD肿瘤病变鸡完全不同;除脑外,MD病鸡组织PRNP基因的表达量均高于健康鸡,其中肿瘤病变组织PRNP基因的表达量显著高于无病变组织(P0.05),而且PRNP基因在MD病鸡肿瘤病变组织与健康鸡组织的表达差异与肿瘤病变程度有关.【结论】PRNP基因的表达量与MDV感染存在相关性,PRNP基因在MD肿瘤组织中过表达,且PRNP基因的差异表达与肿瘤病变程度有关.     

禽网状内皮组织增殖病的组织病理学和超微结构的动态变化

一日龄雏鸡腹腔接种禽网状内皮组织增殖病病毒(REV),观察感染后不同时期肝、脾、心、脑、胸腺、腔上囊、腺胃、十二指肠、盲肠、胰腺和性腺等器官组织的肉眼,组织学和超微结构的变化。根据组织病理学和超微结构检查表明:禽网状内皮组织增殖病(RE)的典型病变是实质细胞坏死和网状细胞增生。本病的靶器官主要是肝脏,其次是心、脾、腺胃、腔上囊、胰腺和性腺等。本病增生的网状细胞,通过光镜和电镜观察,能区别于鸡马立克氏病和淋巴性白血病。此外REV可导致雏鸡发生生长抑制和腔上囊萎缩,因此对病畜的增重和其它禽病的免疲预防具有较大的影响。     

鸡马立克氏病的诊断与防治

正鸡马立克氏病是由疱疹病毒科中的马立克氏病毒感染引起的,以外周神经及性腺、眼虹膜、各种脏器、肌肉、皮肤等组织发生增生性肿瘤病变特征。肿瘤病变以大小不一、种类多样的淋巴细胞、马立克氏细胞增生为病变特征病变。1马立克氏病的诊断方法确诊马立克氏病首先进行流行病学、临床症状观察①最     

Dynamic Pathology and Antigen Location Study on Broiler Breeders with Coinfection of Marek''s Disease Virus and Reticuloendotheliosis Virus

To further understand the generation and development of coinfection of Marek's disease virus (MDV) and reticuloendotheliosis virus (REV) in broiler breeders, and then find the method and optimal time of differential diagnosis for complex clinic multiple infection, the authors studied the pathohistological changes, apoptosis, immunohistochemistry (immunofluorescence), and ultrastrueture of tumor tissues of broiler breeders inoculated with MDV and REV. The study showed that proliferation of small lymphocytes was seen in the main organs at the age of 1 week, then immature lymphocytes, all kinds of lymphocytes, primitive reticulum cells, and Marek's disease cells (MDCs) were observed at 2-9 weeks. Apoptosis of lymphocytes could not be seen until the age of 10 weeks in the immune system. Immunohistochemistry detection showed that the positive signs of MDV and REV antigen were observed in the main organs at 2 weeks of age. Multi-morphology lymphocytes, MDV, and REV, mitotic figures and apoptosis of lymphocytes were observed with the help of transmission electron microscopy. MDV cooperating with REV promotes the course of disease of coinfection. Differential diagnosis can be done by immunohistochemistry in the early stage (before 2 weeks), and histopathology in the late stage (post 4 weeks). MDCs, primitive reticulum cells, immature lymphocytes, and two kinds of virions can serve as a basis for histopathology differential diagnosis.     

Influence of REV and ALV-J Co-Infection on Immunologic Function of T Lymphocytes and Histopathology in Broiler Chickens

The aim of present investigation is to study the effect of single- and co-infection with REV and ALV-J on T lymphocytes bioactivities and histopathology in broiler chickens. The bioactivities of blood and spleen T lymphocytes including lymphoproliferation responses, cytotoxicitic responses, and histopathology of spleen were detected in broiler chickens singly- or co-infected with REV and ALV-J at different days post inoculation and the virus expressions in spleen of infected broiler chickens were detected with immunofluorescence assay （IFA）. The results indicated that blood and spleen T lymphocytes proliferation responses and cytotoxicity in broilers infected with REV or/and ALV-J were inhibited in the whole observed period compared with controls. In the co-infected chickens they were highly inhibited than in the single-infected. The histopathology of spleen in infected chickens at 17 and 37 d post inoculation （dpi） indicated that cell interium increased, the numbers of lymphocytes decreased, and the regrowth were destroyed or decreased, especially more significantly at 17 than at 37 dpi. The different numbers of virus were detected in spleen lymphocytes in REV- infected and/or ALV-J-infected chickens. In the spleen of co-infected chicken, both REV and ALV-J were detected and the total numbers of viruses were more than in chickens singly-infected with REV or ALV-J. Thus, the co-effect of REV and ALV-J caused more immunosuppression on T lymphocytes bioactivities in broiler chickens than single-effect of ALV-J or REV, which contributed to the sever histopathology and the product of tumor cells. This study will be helpful for understanding the effect of co-infection with many viruses and control them in poultry.     

鸡马立克氏病发病过程中肝肾细胞凋亡的电镜观察

通过透射电镜对人工诱发的马立克氏病病鸡的肝、肾细胞进行了细胞凋亡观察,其肝、肾实质细胞发生了细胞凋亡.细胞凋亡呈现多阶段的过程:早期,染色质发生凝聚和边集;中期,染色质凝集十分明显,核变成致密小体,随后裂解成数个团块;后期,凋亡小体形成.肿瘤细胞浸润越严重,细胞凋亡也越明显.凋亡的细胞细胞质内自噬体和同心板层小体形成,内质网扩张成空泡状.细胞膜完整,线粒体无明显变化.     

甘草酸二钾体外诱导感染MDV鸡胚成纤维细胞 凋亡发挥抗病毒作用

【目的】探讨甘草酸二钾体外抗MDV的活性及作用机制。【方法】在体外以鸡胚成纤维细胞为MDV增殖模型,利用MTT比色法、噬斑减少法通过抗病毒试验、病毒复制抑制试验、直接灭活试验来评价甘草酸二钾的抗病毒效果;并通过细胞凋亡试验解释其抗病毒机制。【结果】抗病毒试验结果表明,在安全浓度范围内,甘草酸二钾在体外具有较强的抗MDV的活性,其EC50为（893.5±36.99）µg•mL-1,SI>3.36,最大抑制率达94.4%;在病毒复制抑制试验中,甘草酸二钾可以抑制病毒复制的整个过程;病毒直接灭活试验表明甘草酸二钾可直接杀灭病毒粒子且不呈时间依赖性;细胞凋亡试验结果显示甘草酸二钾能够诱导感染MDV的鸡胚成纤维细胞凋亡。【结论】甘草酸二钾在体外具有抗MDV的活性,可以通过诱导感染病毒的鸡胚成纤维细胞凋亡发挥抗病毒作用。     

马立克氏病鸡MDV血清基因的克隆与鉴定

[目的]克隆马立克氏病鸡MDV血清基因,并对其进行鉴定。[方法]从潜伏期感染马立克氏病鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR扩增马立克氏病毒的L-meq基因。将其插入pMD18-T克隆载体并进行测序,并用DNAman软件进行序列分析。[结果]获得的DNA片段的序列与已发表的L-meq基因序列相一致,表明该试验成功获得了目的基因。[结论]该研究可为鸡马立克氏病的预防与治疗提供新思路和新方法。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式（E451-dk,简称为Es）表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es 在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒（DEV）疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过“Red E/T两步重组”克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞（CEFs）拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情况进行测定。【结果】将重组突变体克隆转染细胞拯救获得了5株重组病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV调控下表达量最高,其表达量较rDEV-Es提高了169.12%。【结论】完成了Es在重组鸭瘟病毒载体中高效表达启动子的筛选,获得了一种调控Es高效表达的启动子pRSV。同时也获得了一株高效表达鸭坦布苏病毒外源基因Es的重组鸭瘟病毒rDEV-pRSV-Es。     

日粮中添加共轭亚油酸对肉仔鸡胸肌和腿肌脂质过氧化状态的影响

【目的】研究日粮中添加共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）对肉仔鸡胸肌和腿肌脂质过氧化状态的影响及原因。【方法】将96只1日龄AA（Arbor Acre）雄性肉仔鸡用玉米豆粕日粮饲喂至3周龄,在3周龄末,将其随机分为对照组和CLA组,分别饲喂基础日粮和CLA日粮,每处理8个重复,每重复6只鸡。42日龄时屠宰,剥离胸肌和腿肌,检测其中的脂肪酸组成和脂质过氧化相关指标。【结果】日粮中添加CLA降低了肉仔鸡胸肌和腿肌的丙二醛（MDA）(P＜0.01)和活性氧含量(P＜0.05)。2组肉仔鸡腿肌和胸肌中各种抗氧化酶活性无显著差异 (P＞0.05)。与对照组相比,CLA组肉仔鸡胸肌和腿肌的谷胱甘肽含量分别提高了21.89％和21.56%(P＜0.01),γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性分别提高了28.57％和25.80%(P＜0.01)。日粮中添加CLA提高了肉仔鸡胸肌和腿肌总CLA(P＜0.01)及饱和脂肪酸（SFA）含量(P＜0.05),极显著降低了单不饱和脂肪酸含量(P＜0.01)。【结论】日粮中添加CLA改变了肉仔鸡胸肌和腿肌脂肪酸的组成,提高了脂质稳定性,同时增加了GSH含量,淬灭了更多的自由基,从而降低了脂质过氧化水平。     

不同免疫状态对肉仔鸡血液生化指标和细胞免疫应答的影响

 【目的】研究不同免疫状态对肉仔鸡血液生化指标和细胞免疫应答的影响。【方法】选用健康情况良好1日龄AA肉公鸡180只,随机分为4组,每组5个重复,每重复9只。设定不同免疫应激模型,为无免疫组即对照组（no vaccine,NV）,常规免疫组（conventional vaccine,CV）,以及在常规免疫基础上注射细菌脂多糖的免疫亢进组（LPS）和环磷酰胺的免疫抑制组（CYP）。采用 CD3/CD4/CD8 三色流式细胞术、MTT法检测肉鸡免疫状态和非免疫状态下外周血中 T 淋巴细胞及其亚群的变化。【结果】与NV组相比,肉仔鸡的体增重和采食量均显著降低LPS组和CYP组（P＜0.05）,各处理料重比无显著差异（P＞0.05）,NV组与CV 组生产性能指标无显著差异（P＞0.05）,各日龄处理间血清TP、GLU和CHLO含量均无显著差异（P＞0.05）。第21和35天,LPS组和CYP组血清ALB含量显著低于CV组和NV组（P＜0.05）;第21 天,LPS组血清α-AGP和 BUN含量显著低于NV组（P＜0.05）,CPY和LPS均抑制T、B淋巴细胞增殖,LPS组CD4+/CD8+T细胞百分比显著低于NV组（P＜0.05）。【结论】未进行免疫肉鸡可维持机体正常的生长性能和细胞免疫稳态,LPS和CYP的刺激可降低肉鸡采食量和体增重;随日龄增加肉鸡对CYP刺激的耐受性有所上升,LPS刺激可增强肉鸡细胞免疫应答反应。