植原体免疫主导膜蛋白Imp基因在大肠杆菌中表达条件优化(英文)

[目的]为了提高植原体膜蛋白Imp基因在E.coliBL21(DE3)中的表达量,优化Imp基因的原核表达条件。[方法]通过设计正交试验,考察不同的培养条件对工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-Imp的影响。在获得最佳培养条件的基础上考察不同诱导条件对Imp蛋白表达量的影响。利用SDS-PAGE和GeneTools凝胶分析软件分析融合蛋白Imp的表达量。[结果]表达条件优化结果表明,最佳培养条件为:温度37℃,pH7.0,装液量20%,振荡速度200r/min。最佳诱导条件为:温度37℃,起始OD600≈1.5,IPTG终浓度0.1mmol/L,诱导培养时间6h。[结论]在最佳条件下Imp表达量达到70.98mg/L,确定了Imp融合蛋白在大肠杆菌的优化表达条件。     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)重组表达条件的优化

为获得更高含量的可溶性N蛋白,对构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-32a-N)的表达条件(如诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行了优化.结果表明:N蛋白最佳诱导表达条件为18℃诱导17h、IPTG浓度0.2 mmol/L;优化后可溶性N蛋白的表达量为22.1 mg/L,比优化前37℃、IPTG浓度1.0 mmol/L条件下诱导4h提高了58.5％.     

重组α-银环蛇毒素融合蛋白的诱导表达及表达条件的优化(英文)

[目的]获得有活性的重组α-银环蛇毒素(alpha-bungarotoxin,α-BGT)融合蛋白。[方法]将质粒pGEX-α-BGT转入BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS等宿主菌中确定最佳工程菌,并对工程菌进行诱导表达,优化可溶性蛋白的诱导表达条件。[结果]确定JP-α-BGT为表达工程菌,并检测到融合蛋白的表达;可溶性蛋白的最佳诱导表达条件:37℃重培养2.5h后,于22℃以0.50mmol/L的IPTG诱导4h,此时其可溶性融合蛋白的表达量达18.42%。[结论]该研究为后续融合蛋白纯化及α-BGT的分离纯化奠定了坚实基础。     

犬传染性肝炎病毒Hexon基因原核表达条件的优化与表达蛋白的活性

[目的]为了提高犬传染性肝炎Hexon蛋白基因在大肠杆菌中的表达量,研究Hexon基因蛋白的最佳表达条件和表达蛋白的活性.[方法]在大肠杆菌菌株BL21(DE3)培养过程中,选择诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IFTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件观察对Hexon融合蛋白表达的影响,以确定最佳表达条件,并用Westem-blot检测重组蛋白的生物活性.[结果]大肠杆菌BL21(DE3)在37℃培养2.25h后,添加终浓度为2.0 mmol/L的IPTG,27℃培养8 h,Hexon重组蛋白表达量最高(1.67mg/mL),所表达的重组蛋白能与犬传染性肝炎阳性血清相结合.[结论]在高浓度IPTG诱导和冷培养条件下,Hexon蛋白基因的表达量最高,表达出的重组蛋白具有很好的反应原性,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础.     

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21（DE3）在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征GP5蛋白和N蛋白在大肠杆菌中的优化表达和纯化

采用不同的培养基、诱导温度、诱导时间、IPTG诱导剂浓度以及诱导菌浓度等大肠杆菌表达条件,进行了融合蛋白HIS-GP5和HIS-N的优化表达和纯化研究.结果表明:重组质粒转化菌E.coli BL21(DE3)在含0.3 mmol/L IPTG的TB培养基中,20℃诱导表达14 h时融合蛋白表达量最高,经纯化得到了HIS-GP5和HIS-N融合蛋白.SDS-PAGE电泳分析表明,纯化的蛋白纯度大于95%.     

犬瘟热病毒N蛋白基因融合蛋白原核表达条件的优化与蛋白纯化

[目的]提高犬瘟热病毒N蛋白基因在大肠杆菌中表达可溶性GST融合蛋白的含量.[方法]研究诱导剂(IPTG)的最佳加入时间、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间以及不同温度条件对GST - CDV N融合蛋白表达的影响,获得在大肠杆菌中的最佳的表达条件,然后再在最佳条件下大量的表达,用GST - Sepharose 4B亲和层析柱对GST - CDV N融合蛋白进行纯化,得到最大量的可溶性融合蛋白,并对蛋白含量进行测定.[结果]大肠杆菌BL21 (DE3)转化菌在37℃培养3.5 h(OD600 =1.314)时,加入IPTG使终浓度为1 mmol/L,然后在27℃诱导8h,GST - CDV N融合蛋白可溶性表达量最高,达到0.862 mg/mL.[结论]确定了犬瘟热病毒N蛋白基因的优化表达条件,为犬瘟热病毒分子免疫学诊断和亚单位疫苗的研制奠定了基础.     

GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及纯化

优化GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中的表达条件,并对其表达产物进行纯化。通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件,SDS-PAGE电泳分析以确定GST-LRF融合蛋白表达的最佳条件。并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱和电洗脱法纯化目的蛋白。结果表明:重组质粒转化菌E.coliBL21(DE3)在37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导5 h时,GST-LRF融合蛋白表达量最高,经电洗脱法纯化得到了GST-LRF融合蛋白。已确定GST-LRF融合蛋白在大肠杆菌的最佳表达条件,并纯化得到目的蛋白,为进一步制备抗LRF的单克隆抗体及LRF功能的研究奠定了基础。     

赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因原核表达条件优化

[目的]优化赤点石斑鱼神经坏死病毒的主衣壳蛋白（MCP）基因的原核表达条件。[方法]采用RT-PCR技术扩增出赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因,构建重组表达载体pRSETA-MCP,以其转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS,在不同培养基、温度、pH值条件下进行诱导表达。[结果]重组菌在SOB和LB培养基、pH值7.0、37℃条件下表达量最高,所得的融合蛋白分子量约为44.5 kD。[结论]该研究为RGNNV-MCP疫苗研制奠定了基础。     

抗真菌活性肽段CGA-N46的免疫学鉴定及其高效表达条件研究

[目的]嗜铬粒蛋白Chromogranin AN端31-76位氨基酸组成的多肽CGA-N46具有较强的抗真菌活性,对其表达条件进行研究具有重要意义。[方法]将CGA-N46基因重组大肠杆菌BL21(DE3,pET-N46)接种于含有氨苄青霉素的2×YT培养基中,于37℃、230r/min振荡培养3 h后加入诱导剂IPTG至终浓度1 mmol/L,25℃条件下诱导6 h,离心收集菌体进行SDS-PAGE蛋白电泳。利用抗6-His的单克隆抗体进行免疫印迹,结果有免疫印迹条带,但表达量不高。鉴于此,对CGA-N46基因的表达条件进行了优化。[结果]在37℃下培养3 h后加入IPTG25℃诱导9 h,目的蛋白表达量较高,当诱导剂IPTG的浓度超过0.4 mmol/L时,其浓度的改变对目的蛋白的表达没有多大影响。     

拟南芥组蛋白甲基化酶SUVH6中SRA结构域基因的克隆及表达

[目的]研究甲基化修饰对遗传基因调节的作用。[方法]利用拟南芥RNA反转录得到的cDNA序列为模板,克隆出SUVH6-SRA基因,并成功构建了含有SUVH6-SRA基因的表达载体pMAL-c2P-SUVH6-SRA,然后将pMAL-c2P-SUVH6-SRA质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,诱导表达带有MBP标签的SUVH6-SRA融和蛋白。[结果]pMAL-c2P-SUVH6-SRA克隆在转化到大肠杆菌BL21（DE3）后,在37℃条件下,经过终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导,大肠杆菌BL21（DE3）能够获得大量可溶性MBP-SUVH6-SRA融和蛋白并顺利表达,SDS-PAGE显示诱导表达的融和蛋白相对分子质量为66.0 kDa左右,与预测的结果相吻合。[结论]在MBP与目的蛋白之间引入了PPE酶切位点,可使MBP和SUVH6蛋白分离,并在使用MBP亲和层析和PPE酶切后,获得了纯度较高的SUVH6蛋白,表明成功构建了SUVH6-SRA-MBP融和蛋白原核表达系统。     

淡紫拟青霉丝氨酸蛋白酶基因克隆表达及抗血清的制备

[目的]探索利用大肠杆菌进行丝氨酸蛋白酶PL基因的克隆与表达及抗血清制备的方法。[方法]根据报道的PL蛋白基因序列设计1对引物,通过RT-PCR扩增获得PL基因片段,对重组载体进行构建、鉴定和序列分析,用表达的特异蛋白条带制备抗原,免疫家兔制备抗血清。[结果]通过RT-PCR扩增得到长约850 bp的PL基因片段,将其克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,获得的重组子pET-22b-PL转化E.coliBL21(DE3),经最终浓度为1 mmol/L IPTG诱导37℃培养4 h,获得约31 kDa大小的重组蛋白。SDS-PAGE电泳分析表明,该蛋白表达量占菌体总蛋白的60%,说明该蛋白得到了高效表达。用表达的特异蛋白条带制备的免疫家兔制备抗血清,经ELISA测定效价为1/10 000。[结论]通过基因重组可获得PL基因在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性。     

拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达研究

[目的]研究拟南芥AtXCD1蛋白的原核表达.[方法]构建XCD1原核表达载体,根据NCBI基因序列设计引物,并以PCR扩增得到大量目的片段XCD1,将XCD1连接到原核表达载体pET-32a＋,并对重组质粒进行测序鉴定,将重组质粒转化至大肠杆菌原核表达菌株BL21（DE3）,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.IPTG诱导表达获得目的蛋白,对蛋白表达条件：诱导时间、诱导温度和IPTG浓度等进行优化.[结果]XCD1序列全长为1 242bp,与PCR产物大小一致.蛋白XCD1-pET-32a＋较适表达条件为在30℃0.1 mmol/L的IPTG诱导1.5h.[结论]该结果为进一步蛋白纯化及酶活测定试验奠定了基础.     

弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内的高效表达研究

[目的]探讨弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内高效表达的条件。[方法]通过SDS-PAGE分析,研究不同菌液密度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间对MIC3基因在大肠杆菌中表达量的影响。[结果]MIC3基因在大肠杆菌中最适表达条件为:菌液密度OD600为0.4,诱导剂IPTG终浓度为0.4mmol/L和诱导时间3.5h。在该条件下表达的融合蛋白经初步分离提纯后,1 L培养液约含融合蛋白143mg,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的49%。[结论]该研究为研究和制备弓形虫病的rMIC3诊断试剂奠定了基础。     

乳糖诱导酸性木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

[目的]以融合酸性木聚糖酶基因的大肠杆菌（E．coli）B121（DE3）为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时重组目的产物的表达规律。[方法]以重组木聚糖酶比酶活为评价指标,利用单因素试验和k（3。）正交试验考察摇瓶发酵条件下诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对木聚糖酶表达的影响。[结果]各因素影响程度依次为：诱导时机〉诱导温度〉诱导时间〉诱导剂浓度;最优表达条件为：诱导剂浓度5∥L、诱导时机0．5h、诱导培养时间4．5h、诱导培养温度32℃;在此工艺条件下,重组木聚糖酶比酶活可达49．69U／mg。[结论]乳糖作为诱导剂能够成功诱导酸性木聚糖酶在大肠杆菌中的表达。     

棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒HaSNPV orf101的原核表达及抗体制备

[目的]摸索棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(HaSNPV)orf101编码蛋白原核表达条件并制备其多克隆抗体。[方法]根据HaS-NPVorf101序列,设计引物,引入适当的酶切位点,利用PCR扩增出基因片段并将其克隆至pGEM-TEasy载体,然后亚克隆至原核表达载体pGEX-KG,检测在不同条件下融合蛋白的表达产量及其折叠性质。原核表达产物经SDS-PAGE分离纯化,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。[结果]在IPTG诱导的条件下,融合蛋白GST-HA101可在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物的大小为55.8 kDa。制备的多克隆抗体经1∶8 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号。[结论]原核表达蛋白及其多克隆抗体的获得为深入研究Ha101的基因功能打下了基础。     

桃果实PpARF1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】为了探讨转录因子ARF1(Auxin Response Factor)对桃果实发育调控的机制。【方法】以‘24号’桃果实为试验材料,构建桃ARF1基因的原核表达载体pET32a-PpARF1,转化到BL21(DE3)中诱导表达菌体蛋白,筛选出重组蛋白的最适表达条件,按照最适条件大量摇菌诱导表达蛋白,并进行重组蛋白的纯化,最后用纯化诱导后的重组蛋白制备多克隆抗体及WB检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测得到pET32a-PpARF1重组蛋白的位置大约在95.0kD,在37℃,转速250r/min,IPTG 0.10mmol/L,诱导4h,诱导出的蛋白表达量最大。免疫印迹试验显示所得抗血清能很好检测到目的蛋白。【结论】ARF转录因子参与生长素调控桃果实发育成熟的过程。