检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查.     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEM T载体上,纯化质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对10份疑似病料和阴性病料进行了检测,发现10份均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出7份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪细小病毒(PPV)的检测.     

猪伪狂犬病毒SYBR-GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立一种定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量PCR方法.[方法]用RT-PCR方法扩增PRRSV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRRSV-N基因重组质粒作为模板来进行检测PRRSV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增.[结果]PRRSV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR的扩增效率为98.2％,标准曲线的决定系数为0.9995,可准确检测的最低核酸模板浓度为60 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性.临床检测显示,PRRS病猪的血清中PRRSV载量极显著(P＜0.01)高于PRRSV亚临床感染猪.[结论]建立了一种可用于PRRSV定量检测与PRRS早期快速诊断的特异性强、灵敏度高、重复性好的PRRSV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法.     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy栽体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N基因保守序列设计引物与TaqMan探针,在建立常规PCR的基础上,设计并优化了TaqMan荧光定量PCR方法用于PRRSV核酸的检测.应用新建立的荧光定量PCR方法检测其它主要猪病病原,无任何非特异性反应;针对PRRSV阳性克隆质粒的检测灵敏度可以达到1.2×101 copy/ml,比常规PCR高100倍;通过对48份临床疑似样本的检测表明有29份样本为PRRSV阳性,与巢式PCR检测结果一致,而常规PCR只能检出其中19份阳性样本,灵敏度优于常规PCR方法.结果表明,试验建立的PRRSV TaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可为PRRSV临床诊断提供一个更为有效的方法.     

一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

一步法CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR诊断方法的建立与初步应用

根据猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,分别设计了1对特异性引物和1条Taq Man探针,建立了一步法检测CSFV和PRRSV双重实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法特异性高,与PCV2,PRV,PPV,PEDV,JEV,BVDV无交叉反应;可以检出20个拷贝数的模板RNA,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)低于4%,方法重复性好。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对50份疑似病例组织进行检测,结果荧光定量RT-PCR检出30份PRRSV阳性,13份CSFV阳性,均高于常规RT-PCR方法的检出数(24份PRRSV阳性,10份CSFV阳性)。本研究建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法具有快速、特异性好、灵敏度高的特点,可用于PRRSV和CSFV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒

选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测.     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

猪繁殖与呼吸道综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μl;利用该方法对3份不同的组织样品进行重复性检测,计算出平均循环阈值的标准差分别为0.14、0.14和0.44,变异系数分别为0.01%、0.01%和0.02%,说明该方法具有良好的重复性和重现性。对阳性组织病料的检测表明,该方法与常规RT-PCR的阳性符合率为100%,但其检测灵敏度较常规RT-PCR约高100倍。     

犬瘟热病毒原液TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种不提取病毒RNA,直接采用Taq Man荧光定量RT-PCR检测样本上清液中犬瘟热病毒的方法。通过扩增CDV的NP基因部分片段构建重组质粒,建立Taq Man荧光定量PCR方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性、重复性检测;比较了提取核酸后进行荧光定量RT-PCR与不提取核酸对原液进行荧光定量RT-PCR检测的结果,最后对疑似CDV病料进行检测。结果显示,建立的CDV质粒Taq Man荧光定量PCR检测灵敏度比普通PCR灵敏度高1 000倍。将核酸提取液和病毒原液稀释后用该研究建立的方法进行检测,最小检测稀释倍数分别为10~7和10~5,表明提取核酸后样本中的有效c DNA浓度比直接使用病毒原液检测高100倍。特异性和重复性检测结果表明,该方法特异性良好且重复性较高。对97份临床病料进行检测,建立的方法共检出60份阳性,阳性检出率高于普通RT-PCR和胶体金快速检测试纸板,提取核酸法与原液法的一致率为100%。标准曲线分析表明,当病毒含量高于10~2拷贝·μL~(-1)时,与普通RT-PCR以及胶体金快速检测试纸板相比,CDV原液Taq Man荧光定量RT-PCR检测技术阳性检出率更高、准确性更好,值得临床推广应用。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立1种猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的荧光定量PCR检测方法.[方法]用RT-PCR方法扩增TGEV的N基因片段,构建含有N基因片段的重组质粒,基于SYBR Green方法以不同浓度的TGEV-N基因重组质粒作为模板进行检测TGEV的荧光定量PCR扩增.[结果]TGEV SYBR Green荧光定量PCR的扩增效率为101％,标准曲线的决定系数为0.9997,可准确检测的最低核酸模板浓度为490 copies/μL,重复性试验的变异系数小于3％,对其他3种常见的猪源RNA病毒的检测结果全为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法.[结论]建立了1种TGEV SYBR Green荧光定量PCR检测方法,可用于TGE的早期快速诊断.     

猪流行性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用

用RT-PCR方法扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段,并克隆到PUC-T载体中,构建含有PEDV M基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ进行PEDV检测的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为100.4%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测520拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用所建立方法对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率显著(P0.05)高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测PEDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于PEDV的定量检测和猪流行性腹泻的早期快速诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因的保守序列设计引物,以TEGV疫苗毒株为模板,克隆S基因,并构建重组阳性质粒,优化反应体系和扩增条件,建立基于SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、重复性和灵敏度进行分析。结果显示:建立的检测方法灵敏度可达10拷贝/μL,标准曲线线性关系良好(r=0.997),扩增效率高,具有良好的特异性和重复性。使用该方法对124份临床疑似TGEV病料进行检测,阳性样本有17份,检测样本的阳性率为13.7%。该方法可用于兽医临床上TGEV的快速检测和流行病学分析。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

根据文献合成1对针对PRRSV毒株ORF6基因高度保守序列的引物,建立用于检测PRRSV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR诊断方法.提取PRRSV-LC病毒RNA,经所建立的荧光定量RT-PCR方法扩增,可获得特异的扩增曲线,而日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒(PCV)进行同条件检测,结果为阴性;方法可检测到1 TCID_(50) PRRSV,比琼脂糖凝胶电泳敏感度高10～100倍.结果表明,所建立的PRRSV荧光定量RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和科学研究.     

猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR Green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL。结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中猪细小病毒VP2基因序列设计特异性的引物,PCR扩增获得猪细小病毒VP2基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品.通过对SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪细小病毒的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法,以此为基础研制出试剂盒.试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PCV-2、E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增,可重复性好,测灵敏度可达1.0×101拷贝/μL.结果表明,研制的猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等优点,适合于猪细小病毒临床样品的检测.     

猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据GenBank中登录的猪轮状病毒(PoRV)VP6基因序列特征,设计特异性的引物和探针,条件优化后,建立检测PoRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法.结果表明:建立的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,最低可检测192拷贝·μL~(-1);特异性强,对猪常见病原(如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒等)检测均为阴性;重复性好,扩增相关系数为0.999,其组内和组间变异系数分别为0.25%~1.26%和0.31%~1.49%.对临床收集的79份猪腹泻病料进行常规RT-PCR检测,检测出阳性样品4份,阳性率为5.06%(4/79);对这79份病料进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测,检测出阳性样品6份,阳性率为7.59%(6/79);同时,4份经RT-PCR检测为阳性的样品经TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测均为阳性,符合率达100%.本研究建立的方法为PoRV早期感染诊断提供检测手段.