一步法TaqMan~探针实时荧光定量RT-PCR快速检测PRRSV的建立及初步应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,建立了一步法检测PRRSV的荧光定量RT-PCR方法。结果表明,建立的方法具有较高的特异性,与PCV,JEV,SFV,PRV,PPV无交叉反应;可以检测到10个拷贝数的模板RNA或1个TCID50的PRRSV,比常规RT-PCR方法的灵敏度高10倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<1%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对72份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出40份阳性,高于常规RT-PCR方法(28份阳性)。建立的荧光定量RT-PCR方法特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于PRRSV的实验室快速诊断和流行病学调查。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR(RT-PCR)技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查.     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

多重实时定量PCR快速检测PRRSV、CSFV和PCV2混合感染方法的建立

根据TaqMan复合荧光探针设计原则,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物和探针,优化反应条件,建立了检测PRRSV、CSFV和PCV2的单项和多重Real-time PCR方法。结果表明,建立的方法具有高度特异性,与其他病原检测无明显交叉反应;对阳性质粒和病毒的最低检测量分别为<101个拷贝和<1TCID50/反应,检测灵敏度比常规PCR检测高100倍。通过对20份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果一致。建立的多重Real-time PCR方法可用于同时快速检测PRRSV、CSF和PCV2的混合感染,具有灵敏、特异、重复性好并能对样品进行定量检测等优点。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的建立

针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N基因保守序列设计引物与TaqMan探针,在建立常规PCR的基础上,设计并优化了TaqMan荧光定量PCR方法用于PRRSV核酸的检测.应用新建立的荧光定量PCR方法检测其它主要猪病病原,无任何非特异性反应;针对PRRSV阳性克隆质粒的检测灵敏度可以达到1.2×101 copy/ml,比常规PCR高100倍;通过对48份临床疑似样本的检测表明有29份样本为PRRSV阳性,与巢式PCR检测结果一致,而常规PCR只能检出其中19份阳性样本,灵敏度优于常规PCR方法.结果表明,试验建立的PRRSV TaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可为PRRSV临床诊断提供一个更为有效的方法.     

犬瘟热病毒原液TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种不提取病毒RNA,直接采用Taq Man荧光定量RT-PCR检测样本上清液中犬瘟热病毒的方法。通过扩增CDV的NP基因部分片段构建重组质粒,建立Taq Man荧光定量PCR方法,对所建立的方法进行特异性、敏感性、重复性检测;比较了提取核酸后进行荧光定量RT-PCR与不提取核酸对原液进行荧光定量RT-PCR检测的结果,最后对疑似CDV病料进行检测。结果显示,建立的CDV质粒Taq Man荧光定量PCR检测灵敏度比普通PCR灵敏度高1 000倍。将核酸提取液和病毒原液稀释后用该研究建立的方法进行检测,最小检测稀释倍数分别为10~7和10~5,表明提取核酸后样本中的有效c DNA浓度比直接使用病毒原液检测高100倍。特异性和重复性检测结果表明,该方法特异性良好且重复性较高。对97份临床病料进行检测,建立的方法共检出60份阳性,阳性检出率高于普通RT-PCR和胶体金快速检测试纸板,提取核酸法与原液法的一致率为100%。标准曲线分析表明,当病毒含量高于10~2拷贝·μL~(-1)时,与普通RT-PCR以及胶体金快速检测试纸板相比,CDV原液Taq Man荧光定量RT-PCR检测技术阳性检出率更高、准确性更好,值得临床推广应用。     

人双埃克病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能快速、简便、灵敏地检测人双埃克病毒(Human Parechovirus,HPeV)SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank发表的人双埃克病毒8个基因型的参考毒株全序列,针对5′端非编码区保守序列设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增此靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板,经过优化反应条件,建立标准曲线和融解曲线,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价;检测临床粪便样品共156份,并与常规套式RT-PCR检测结果进行比较。结果显示,建立的标准曲线Ct值与模板浓度呈现良好的线性关系(r2=0.999),融解曲线特异,检测灵敏度可达60拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍,重复性变异系数小(<1%),能特异地检测HPeV。临床样本检测结果也表明该法(检出30份)灵敏度高于套式RT-PCR(检出21份)。实验结果证明建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,有望成为HPeVs的分子诊断、流行病学调查等相关研究的工具。     

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立一种灵敏度高、特异性强、重复性好,能快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法。根据BVDV的E2基因保守序列,设计合成一对特异性引物,建立了检测BVDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将标准阳性样品10倍梯度稀释检测灵敏度,用能感染奶牛的其它病毒做对照检测特异性,用临床样本检测重复性。结果表明,该方法与能感染奶牛的其它几种病毒均无交叉反应,检出敏感度达4.87×10~1 copies/μL,比常规PCR检测方法高10倍。同时检测了5个规模化奶牛场送检的67份奶牛腹泻样本,其BVDV检出率为46.27%(31/67)。本研究成功建立了BVDV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为BVDV的快速诊断和定量分析提供了技术支撑,具有很好的应用前景。     

猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法的建立

根据GenBank中登录的猪轮状病毒(PoRV)VP6基因序列特征,设计特异性的引物和探针,条件优化后,建立检测PoRV TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法.结果表明:建立的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法敏感性高,最低可检测192拷贝·μL~(-1);特异性强,对猪常见病原(如猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒等)检测均为阴性;重复性好,扩增相关系数为0.999,其组内和组间变异系数分别为0.25%~1.26%和0.31%~1.49%.对临床收集的79份猪腹泻病料进行常规RT-PCR检测,检测出阳性样品4份,阳性率为5.06%(4/79);对这79份病料进行TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测,检测出阳性样品6份,阳性率为7.59%(6/79);同时,4份经RT-PCR检测为阳性的样品经TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法检测均为阳性,符合率达100%.本研究建立的方法为PoRV早期感染诊断提供检测手段.     

猪瘟病毒实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测猪瘟病毒的基因检测方法,根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)基因组NS2基因序列设计并合成引物和Taq Man探针,通过各项条件优化并以10倍稀释度的质粒为标准品进行实时定量PCR扩增制作标准曲线,建立检测CSFV的实时定量PCR方法。该方法的检测灵敏度可达每微升10个拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高出1个数量级;对标准品质粒检测的线性范围是1.0×109～1.0×101μL-1。对1.0×107、1.0×105、1.0×103μL-13种稀释度的标准品质粒进行重复试验,批内变异系数分别是0.30%、0.85%、0.43%,批间变异系数分别是0.81%、1.36%、0.63%,具有良好的重复性。应用该方法对45份临床样品进行检测,检出26份阳性样品,而常规PCR只检测出19份阳性样品,说明该实时定量PCR方法的敏感性高于常规PCR。可见,该方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可用于检测病料中的猪瘟病毒。     

4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检测方法,该方法对临床150份样品的检测结果显示,CSFV阳性样品有25份,高致病性PRRSV阳性样品有45份,PCV-2阳性样品有70份,PPV的检测结果全部为阴性,其中混合感染样品有18份。【结论】建立了对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV 4种猪群常见病毒的基因芯片检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

猪瘟病毒强毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为准确快速诊断猪瘟病毒(classical swine fever virus,简称CSFV)强毒,对GenBank已公布的CSFV的基因组全序列进行分析,根据CSFV-5'NTR核苷酸序列设计1对特异的荧光定量引物,建立快速检测猪瘟病毒强毒株SYBR Green-Ⅰ实时荧光定量PCR方法。结果表明,该法具有很好的敏感性,对猪瘟病毒最低检出量为10拷贝/μL;特异性强,与猪瘟兔化弱毒苗、伪狂犬病毒(简称PRV)、猪细小病毒(简称PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(简称PRRSV)、圆环病毒组织苗(简称PCV2)没有交叉反应;重复性好,变异系数(CV)为0.47%~1.36%。该方法可用于猪瘟病毒的快速检测。     

CSFV和PRRSV二联RT-PCR检测方法的建立

参照GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)基因保守序列,设计2对特异引物,通过对最佳反应条件的优化,建立了CSFV和PRRSV的二联RT-PCR检测方法,该方法可同时扩增得到2条与试验设计相符的443 bp(CSFV)和246 bp(PRRSV)特异性条带。应用该二联RT-PCR方法检测猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结果均为阴性,证明该方法有良好的特异性。将已知阳性病毒PCR模板最高稀释倍数作为PCR的敏感度,结果表明该二联RT-PCR体系扩增的敏感度为10-3,可对CSFV和PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的建立

根据文献合成1对针对PRRSV毒株ORF6基因高度保守序列的引物,建立用于检测PRRSV的SYBR Green I荧光定量RT-PCR诊断方法.提取PRRSV-LC病毒RNA,经所建立的荧光定量RT-PCR方法扩增,可获得特异的扩增曲线,而日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒(PCV)进行同条件检测,结果为阴性;方法可检测到1 TCID_(50) PRRSV,比琼脂糖凝胶电泳敏感度高10～100倍.结果表明,所建立的PRRSV荧光定量RT-PCR诊断方法特异性好、敏感性高,可进一步应用于猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和科学研究.     

新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL^-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。     

江苏部分地区猪高热病中猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测

猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征)病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提.根据已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因的保守序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的保守序列,设计合成了2对特异引物,分别扩增出大小为509 bp和372 bp的特异性基因片段,通过优化RT-PCR条件,分别对江苏不同地区送检的21份病死猪的血清、淋巴结、肺、肝、脾、心脏等组织进行单重RT-PCR检测.结果4份CSFV阳性,9份PRRSV阳性,其中3份CSFV和PRRSV同时为阳性.结果表明,CSFV和PRRSV单重RT-PCR诊断方法具有高度特异性,可用于临床诊断.     

黄瓜花叶病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立检测香蕉中黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus(CMV)的实时荧光定量方法.【方法】根据CMV外壳蛋白(CP)保守序列设计了TaqMan实时荧光定量PCR特异性探针及引物,优化反应体系检测TaqMan探针实时荧光定量方法的灵敏度、特异性和重复性.【结果和结论】该方法检测灵敏度为4.2×102μL-1,比普通PCR高100倍,且与香蕉束顶病毒Banana bunchy top virus(BBTV)、香蕉线条病毒Banana streak virus(BSV)无交叉反应,特异性和重复性都较好.用实时荧光定量PCR检测14份田间香蕉样品有5份样品为阳性,进一步证明建立的实时荧光定量方法可用于香蕉CMV的检测.     

猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR方法进行比较。【结果】建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线的斜率为-3.383,R2=0.998,具有良好的线性关系;重复性试验结果表明,该方法循环数阈值Ct的变异系数(CV)为0.86%～1.02%,具有良好的稳定性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为5.06copies/μL;特异性检测结果显示,该方法对猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,对PCV-2标准品的检测结果为阳性,说明该方法具有较好的特异性。临床样品的检测中,所建立的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。【结论】成功建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对PCV-2的检测。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.     

非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法，本研究根据GenBank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针，通过优化PCR反应体系和反应条件，建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法，验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示：本研究所建立的检测方法特异性强，与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应；灵敏度高，能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好，组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑，为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。