猪萨佩罗病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立快速、特异、灵敏的猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus,PSV）TaqMan实时荧光定量（RT-qPCR）检测方法,为临床快速检测PSV提供新方法。【方法】参照GenBank中PSV的全基因序列,针对PSV 5′端保守区设计1对特异性引物,PCR扩增目的片段,将目的片段克隆至pMD 18T载体,构建阳性重组质粒,并以阳性质粒标准品为模板,建立标准曲线。在此基础上,设计特异性引物与探针,进行反应体系和反应条件优化,建立PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。应用建立的方法对2018-2019年在河南不同地区猪场收集的83份样品（粪便样品39份,肠道样品44份）进行检测。【结果】建立了PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法的灵敏度为3.88×10¹拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,特异性良好;批内与批间变异系数均小于1.0%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TaqMan RT-qPCR检测PSV呈阳性的样品有31份（22份粪便样品,9份肠道样品）检出率为37.3%（31/83）,显著高于普通PCR检测结果（检出率12.0%（10/83））。【结论】建立了TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性好。     

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒（PPV）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPV VP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy 载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg²⁺浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量 PCR 反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】 在25 μL扩增体系中,Mg²⁺终浓度为4.5 mol/L、SYBR Green染料浓度为20 μmol/L、引物浓度为25 μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20 TCID₅₀/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】 成功建立了PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。     

4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛轮状病毒（BRV）、牛恶性卡他热病毒（MCFV）4种致牛腹泻病毒多重荧光定量PCR检测方法,为BVDV、BCoV、BRV和MCFV的鉴别诊断提供技术支持。【方法】根据BVDV的5′UTR基因、BCoV的N基因、BRV的VP6基因和MCFV的ORF9基因的保守区域设计引物,克隆目的基因构建标准阳性重组质粒,建立可同时检测4种致牛腹泻病毒的多重荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。用建立的多重荧光定量PCR检测方法对76份临床样品进行检测,并与常规PCR检测方法的结果进行比较。【结果】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法建立的标准曲线线性关系良好,仅可特异性扩增出4种目标基因片段;对BVDV、MCFV、BRV和BCoV的最低检出限分别为9.4×10¹,1.4×10³,9.1×10¹和1.2×10²拷贝/μL,与普通PCR相比,灵敏性高出10～1 000倍;批内、批间差异均小于5%。76份临床样品检测结果显示,多重荧光定量PCR检测结果与普通PCR检测结果的符合率分别为98.7%（BCoV）、97.4%（BRV）、100.0%（BVDV）和100.0%（MCFV）。【结论】建立了BVDV、BCoV、BRV和MCFV多重荧光定量PCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牛腹泻病毒病原的实验室检测。     

2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RT-PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49copies/μL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性。该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RTPCR方法检测结果无显著性(P0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验，然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示，PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异，临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法，近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测...     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR检测方法的建立及在初乳检测上的应用

为了提高初乳中猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的检出率,避免初生仔猪受到带毒初乳的危害,建立了一种SYBR GreenⅡ荧光定量PCR(qPCR)检测方法。根据Gen Bank已发表的TGEV的N基因序列,选择保守区域设计、合成了1对特异性引物,扩增TGEV的N基因片段(174 bp),构建含有N基因片段的重组质粒,以重组质粒作为模板建立了特异性检测TGEV的qPCR检测方法。该方法的灵敏性比普通PCR方法高,应用建立的qPCR检测方法,对2016年10月-2017年4月采集自四川省部分地区腹泻猪场的母猪初乳130份进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较。结果显示:用qPCR方法检测,130份样本中有13份为TGEV阳性,而普通PCR方法只检测到5份TGEV阳性样本。说明qPCR检测方法的敏感性高于普通PCR方法,更适合用于猪初乳检测。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy栽体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法...     

猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及在疫苗评价中的应用(英文)

[目的]建立检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的TaqMan荧光定量PCR方法。[方法]根据TGEV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。[结果]该试验建立的荧光定量PCR方法在102~1010拷贝/μl之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90%~110%之间。该方法的检测灵敏度为10拷贝,敏感性较高,而且特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应;批内和批间的变异系数低于3%,表明该方法的重复性较好。应用该方法可以对疫苗的免疫效力进行定量检测和评价,也可以对临床病料进行检测。[结论]该研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,可为TGEV的流行病学调查、疫苗开发和发病机制等研究提供可靠的工具。     

犬瘟热病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

[目的]建立一种犬瘟热病毒(CDV) RT-nested PCR检测方法.[方法]根据CDV弱毒株Onderstepoort 的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性、重复性实验.[结果]特异性试验表明,该方法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)以及正常Vero细胞中均未扩增出该条带.敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-3稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者.重复性实验表明,不同情况下的3次重复实验,结果相同.用RT-nested PCR对石河子地区疑似感染CDV的病料进行检测,结果表明,该研究建立的RT- nested PCR不仅能有效的检测CDV感染,而且能够检测不同组织的样品.[结论]建立的RT-nested PCR检测方法,适用于动物CDV的快速诊断和流行病学调查.     

基于单链置换的环介导间接PCR鉴别PEDV、TGEV方法的建立及应用

【目的】猪病毒性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)所引起的一种急性肠道传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水、高发病率和死亡率为主要特征。PEDV与TGEV同属α冠状病毒,可以感染各年龄段猪只,尤其对仔猪的危害最为严重,可导致大量仔猪死亡,给养殖业造成严重经济损失。由于PEDV和TGEV感染在临床症状、病理变化和流行病学上极为相似,临床上很难区分,因此,建立一种高效、特异的临床鉴别诊断方法对于预防病毒性腹泻的爆发流行具有重要意义。本试验旨在建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)环介导间接PCR检测方法,用于猪病毒性腹泻的病原学鉴别诊断。【方法】根据Gen Bank数据库中PEDV和TGEV基因组序列信息,在对两种病毒基因序列同源性比较的基础上,分别选取PEDV和TGEV核蛋白(N)基因序列的一段高度保守区,设计两条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的TOC1基因片段两端,作为特异性标记的报告基因。此报告基因与待测靶标基因经杂交、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立PEDV/TGEV鉴别诊断方法,扩增片段大小分别为404、252bp。【结果】该方法特异性好,可单独或同时检测PEDV和TGEV,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型轮状病毒(RAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等常见猪源性病毒无交叉扩增;检测灵敏度高,对PEDV和TGEV的最低极限浓度分别为1.6和8 pg·μL-1的核酸样品,两种病原的同时检测不影响检测灵敏度;采用环介导间接PCR、常规RT-PCR和Sybr Green实时PCR对157份临床样本进行比较检测,3种方法的PEDV检出率分别为33.76%、21.66%和36.31%,TGEV检出率分别为26.75%、13.38%和28.03%;kappa检验结果,环介导间接PCR、Sybr Green实时PCR两种方法对PEDV和TGEV检测结果的符合度均为96.18%(κ≥0.90)【结论】环介导间接PCR可以用于鉴别诊断PEDV/TGEV,是一种快速、准确、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

新现猪Delta冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用

【目的】猪Delta冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）是近年来新发现的可引起猪只,特别是新生仔猪腹泻的冠状病毒,其引发的腹泻具有较高的发病率和死亡率,是造成新生仔猪死亡的重要原因之一。试验拟建立新现PDCoV RT-PCR检测方法,并调查当前江西腹泻猪群中PDCoV的感染情况。【方法】通过对GenBank数据库中PDCoV全基因组序列的比对分析,找出保守序列,用Primer 3.0在线软件设计1对扩增PDCoV核衣壳（N）蛋白基因片段的特异性引物,基于该引物建立PDCoV RT-PCR检测方法;用建立的方法检测腹泻猪粪便及肠道样品,挑选阳性扩增产物进行克隆、测序;用本试验获得的PDCoV序列与其他国家或地区的PDCoV序列以及猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）共同构建进化树,分析PDCoV各毒株及其与PEDV和TGEV之间的进化关系;以PEDV、TGEV、猪库布病毒（PKoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及猪瘟病毒（CSFV）RNA为模板验证引物的特异性;构建PDCoV核衣壳蛋白基因片段重组质粒,并以系列稀释的重组质粒为模板确定所建立的PDCoV RT-PCR方法的敏感性;应用建立的RT-PCR方法调查249份2012-2015年江西省猪群腹泻样品中PDCoV的存在情况,随机抽取一定数量的RT-PCR阳性扩增产物进行克隆、测序进一步验证反应的特异性。【结果】①以腹泻猪粪便样品RNA为模板,应用所设计的特异性引物扩增出了329 bp的单一条带,与预期目的片段大小一致,扩增产物经克隆后测序,将获得的序列与NCBI GenBank数据库序列进行比对,比对结果表明试验所获得的序列与数据库中PDCoV序列的同源性高达99.1%,证明所扩增的序列属于PDCoV;②将8条本试验获得的PDCoV N基因片段序列与18株其他国家或地区的PDCoV毒株以及PEDV、TGEV的相应N基因片段序列构建进化树,结果表明26条PDCoV序列属于同一个分支,而PEDV和TGEV则分别属于不同的分支。试验获得的PDCoV序列与韩国PDCoV毒株KNU14-04亲缘关系最近,同源性高达99.1%;与两株香港毒株HKU 15-44和HKU 15-155亲缘关系相对较远;③本试验建立的RT-PCR方法特异性强,仅能扩增出PDCoV,而对PEDV、TGEV、PKoV、PAstV、PRRSV及CSFV核酸无交叉扩增现象;④所建立的RT-PCR方法灵敏度高,将含扩增片段的重组质粒以1.0×10⁶拷贝/μL为起始浓度依次10倍稀释至1.0×10¹拷贝/μL作为模板验证方法的灵敏度,结果表明所建立的方法对PDCoV最低可检出量为1.0×10³拷贝/μL;⑤应用建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年采集自江西省各地区的腹泻母猪粪便及腹泻仔猪粪便/肠道样本,结果显示腹泻样本中PDCoV的检出率为31.33%（78/249）,母猪粪便中PDCoV的检出率（27.78%）稍低于仔猪粪便及肠道样品PDCoV的检出率（31.92%）,最早可从2012年的样品中检测出PDCoV。【结论】试验成功建立了检测新现PDCoV的RT-PCR方法;应用所建立的RT-PCR方法检测了249份2012-2015年江西地区猪群临床腹泻样品中PDCoV存在情况,结果表明PDCoV是一种普遍存在于腹泻猪群中的病毒;研究建立的RT-PCR方法对猪群PDCoV的临床诊断和流行病学调查等具有应用价值。     

猪传染性胸膜肺炎的ApxIV—ELISA检测方法

【目的】建立一种敏感性好、简便快捷,适用于临床诊断、实验室检测和血清学调查的诊断技术,为规模化养猪场监控胸膜肺炎放线杆菌（APP）感染及净化猪传染性胸膜肺炎（PCP）提供技术支撑。【方法】以ApxIV重组蛋白为抗原,建立ApxIV-ELISA检测方法,经可行性、特异性、准确性、重复性检验后,对采自广西南宁周边地区随机抽取的未免疫APP疫苗育肥猪与经产母猪进行血清抗体检测。【结果】经试验证实,以ApxIV-ELISA检测APP具有可行性,且具有特异性良好、准确性较高、重复性较好的特点,其判断标准：S（样品孔OD630 nm）≥0.397为阳性,S＜0.397为阴性。以ApxIV-ELISA检测的90份血清样品中有40份为阳性,阳性率为44.4%;其中经产母猪阳性血清33份,占总阳性血清的82.5%。【结论】广西南宁周边地区的养猪场已普遍存在APP感染,特别是经产母猪较严重。采用ApxIV-ELISA检测方法能及时鉴别诊断猪群的APP感染情况,且敏感性好、简便快捷,适用于临床诊断、实验室检测和血清学调查。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因的保守序列设计引物,以TEGV疫苗毒株为模板,克隆S基因,并构建重组阳性质粒,优化反应体系和扩增条件,建立基于SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、重复性和灵敏度进行分析。结果显示:建立的检测方法灵敏度可达10拷贝/μL,标准曲线线性关系良好(r=0.997),扩增效率高,具有良好的特异性和重复性。使用该方法对124份临床疑似TGEV病料进行检测,阳性样本有17份,检测样本的阳性率为13.7%。该方法可用于兽医临床上TGEV的快速检测和流行病学分析。     

牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR Green I 实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列（No. MBU87961,gi9954088）设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green I实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR Green I实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。     

4种猪群常见病毒基因芯片检测方法的建立与应用

【目的】建立猪瘟病毒(CSFV)、高致病性猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)及猪细小病毒(PPV)的基因芯片检测方法,为这4种病的实验室诊断和流行病学调查提供一种快速、高效的病原学诊断方法。【方法】根据GenBank中CSFV、高致病性PRRSV、PCV-2、PPV的相关基因序列,设计合成相关引物,采用PCR方法得到具有荧光标记的PCR产物,然后与含有特定检测探针的芯片进行杂交,建立其基因芯片检测方法,并对该方法的灵敏性和重复性进行检测。应用建立的基因芯片检测方法,对150份临床样品进行检测。【结果】建立了针对CSFV、PRRSV、PCV-2和PPV 4种病毒的基因芯片检测方法,该方法对临床150份样品的检测结果显示,CSFV阳性样品有25份,高致病性PRRSV阳性样品有45份,PCV-2阳性样品有70份,PPV的检测结果全部为阴性,其中混合感染样品有18份。【结论】建立了对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV 4种猪群常见病毒的基因芯片检测方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。     

辣椒脉斑驳病毒的多基因联合检测与鉴定

【目的】辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）是辣椒生产上危害严重的病毒,也是口岸检疫的重要病毒之一。本文旨在建立一种快速检测ChiVMV的多基因联合检测方法,实现ChiVMV的快速、准确鉴定。【方法】利用DAS-ELISA、RT-PCR方法对印度进境辣椒进行检测以确定是否携带有ChiVMV。根据ChiVMV外壳蛋白（coat protein,CP）和圆柱状内含体蛋白（cytoplasmic inclusion protein,CI）保守区域分别设计引物,筛选两个基因（CP和CI）的特异性引物组合,通过设定不同的引物用量组合以及对退火温度等条件进行优化,探索最佳的反应条件,建立多基因联合检测方法。利用建立的多基因联合检测体系对包含ChiVMV在内的辣椒病毒进行检测,以验证该体系特异性。同时对ChiVMV阳性样品的不同浓度cDNA进行扩增,测定其检测灵敏度。此外,对田间辣椒样本进行检测,以验证体系的实际应用效果。【结果】通过对印度进境辣椒的DAS-ELISA检测,发现样品提取液与ChiVMV呈阳性反应;利用CP861-F/CP861-R特异性引物对进行RT-PCR,扩增出与预期大小相一致的特异性片段,确认该批辣椒样品携带有ChiVMV。多基因联合检测体系中,应用引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R分别扩增出长度为337、655 bp的特异性目的片段。经优化后的反应体系和程序为cDNA 2 μL、CP337-F/CP337-R各0.625 μL（10 μmol·L^-1）、CI655-F/CI655-R各1.375 μL（10 μmol·L^-1）、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH₂O 6.5 μL,退火温度50℃,共35个循环。建立的多基因联合检测方法具有良好的特异性和灵敏度,两个基因检测灵敏度均为10^-4数量级。实际应用检测结果表明,该方法可从感染ChiVMV的样品中同时扩增出CP和CI的特异性目的片段。【结论】建立的多基因联合检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点,可为辣椒脉斑驳病毒的快速检测提供可靠的技术支持。     

植物罹病组织中象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法

【目的】建立一种基于环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术,从植物罹病组织中直接检测象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii）的快速检测方法,为象耳豆根结线虫的监测和防治提供技术支持。【方法】根据象耳豆根结线虫与其它根结线虫ITS序列差异设计LAMP特异性引物,通过对LAMP反应条件中的Mg2+、dNTPs、甜菜碱和反应时间进行优化,同时对检测体系的特异性和灵敏度进行验证,建立一种从罹病植物组织中检测象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法。【结果】象耳豆根结线虫LAMP检测体系优化结果表明在Mg2+的浓度为5.0 mmol•L-1、dNTPs的浓度为2.4 mmol•L-1、不添加甜菜碱、反应时间为45 min的条件下,扩增效率最优。本研究建立的LAMP检测方法能够从11个植物线虫种群中特异检测出象耳豆根结线虫,检测灵敏度为1/200000头线虫DNA,比普通PCR灵敏100倍,能够直接从植物根结中检测出象耳豆根结线虫,准确度为100%。【结论】本研究以rDNA-ITS序列为靶基因建立象耳豆根结线虫LAMP快速分子检测方法,具有特异性强、灵敏度高、简单、快速、经济等特征,能够从罹病植物组织中快速准确地检测出象耳豆根结线虫,具有极高的实践应用价值。