2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RT-PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49copies/μL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性。该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RTPCR方法检测结果无显著性(P0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验，然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示，PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异，临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法，近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

TGEV和PEDV的多重PCR方法在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用研究

目的:通过应用同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的多重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验。方法:对本地区150份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测,检测了仔猪腹泻的粪便或小肠组织共150份病料。在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、544 bp(TGEV)、275 bp(PARV)特异性片段,而其它病毒无特异性条带。结果:PEDV、TGEV阳性率分别为54.67%(82/150)、8.0%(12/150)。PEDV与TGEV混合感染率为5.33%。结论:同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的多重RT-PCR方法的应用对临床上进行这两种疾病混合感染的检测具有重要意义。     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×10~3、4×10~3 copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性。该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(P0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于PCV1。【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势。     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用.【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测.【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×103、4×103copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性.该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(Pgt;0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于PCV1.【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势.     

猪圆环病毒1型与2型双重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种可同时检测猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)的双重PCR检测方法并进行临床应用.【方法】对PCV1和PCV2的单项PCR方法分别进行条件优化后对两种病毒的双重PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项PCR方法和双重PCR对临床样品进行比较检测.【结果】双重PCR检测方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×103、4×103copies/μL,该方法对当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性.该方法对2013—2017年15个猪场的145份断奶仔猪样品的检测结果显示,PCV1和PCV2的个体阳性率分别为11.7%和77.2%,与单项PCR方法检测结果无显著(Pgt;0.05)差异,且两种方法检出的PCV1或PCV2的阳性猪场完全一致;临床样品中PCV2的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于PCV1.【结论】建立了一种有较高敏感性与特异性的PCV1和PCV2的双重PCR检测方法,当前猪场中PCV2感染较PCV1感染明显占优势.     

基于单链置换的环介导间接PCR鉴别PEDV、TGEV方法的建立及应用

【目的】猪病毒性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)所引起的一种急性肠道传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水、高发病率和死亡率为主要特征。PEDV与TGEV同属α冠状病毒,可以感染各年龄段猪只,尤其对仔猪的危害最为严重,可导致大量仔猪死亡,给养殖业造成严重经济损失。由于PEDV和TGEV感染在临床症状、病理变化和流行病学上极为相似,临床上很难区分,因此,建立一种高效、特异的临床鉴别诊断方法对于预防病毒性腹泻的爆发流行具有重要意义。本试验旨在建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)环介导间接PCR检测方法,用于猪病毒性腹泻的病原学鉴别诊断。【方法】根据Gen Bank数据库中PEDV和TGEV基因组序列信息,在对两种病毒基因序列同源性比较的基础上,分别选取PEDV和TGEV核蛋白(N)基因序列的一段高度保守区,设计两条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的TOC1基因片段两端,作为特异性标记的报告基因。此报告基因与待测靶标基因经杂交、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立PEDV/TGEV鉴别诊断方法,扩增片段大小分别为404、252bp。【结果】该方法特异性好,可单独或同时检测PEDV和TGEV,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型轮状病毒(RAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等常见猪源性病毒无交叉扩增;检测灵敏度高,对PEDV和TGEV的最低极限浓度分别为1.6和8 pg·μL-1的核酸样品,两种病原的同时检测不影响检测灵敏度;采用环介导间接PCR、常规RT-PCR和Sybr Green实时PCR对157份临床样本进行比较检测,3种方法的PEDV检出率分别为33.76%、21.66%和36.31%,TGEV检出率分别为26.75%、13.38%和28.03%;kappa检验结果,环介导间接PCR、Sybr Green实时PCR两种方法对PEDV和TGEV检测结果的符合度均为96.18%(κ≥0.90)【结论】环介导间接PCR可以用于鉴别诊断PEDV/TGEV,是一种快速、准确、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

猪传染性胃肠炎及流行性腹泻病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的序列,利用Primer 5.0设计合成了2对特异性引物。用这2对引物对TGEV、PEDV cDNA模板首先进行单项PCR条件优化,然后采用正交试验设计优化多重RT-PCR反应条件,结果同时扩增到2条与实验设计相符的492bp(PEDV)和211bp(TGEV)特异性条带,建立了能够同时检测2种病毒混合感染的特异、灵敏的多重PCR检测方法,可检测出约11pg的PEDV和13pg的TGEV。     

规模化猪场仔猪腹泻4种病原的感染情况调查

采用PCR和RT-PCR技术,对福建省16个规模化猪场的仔猪腹泻样本进行致病性大肠杆菌(EPEC)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(RDV)的感染情况调查。结果表明:15个猪场EPEC检测为阴性,1个猪场同时检测到大肠杆菌K88的201 bp条带和仔猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛蛋白的510 bp条带,EPEC的阳性率为6.25%。1个猪场检测到TGEV的497 bp特有条带,TGEV的阳性率为6.25%。3个猪场检测到PEDV的854 bp特有条带,PEDV的阳性率为18.75%。3个猪场检测到RDV的342 bp特有条带,RDV的阳性率为18.75%。1个猪场同时感染EPEC和PEDV 2种病原,其余的15个猪场均为单一病原感染。表明福建省规模化猪场的仔猪腹泻仍然存在EPEC、TGEV、PEDV、RDV病原感染,呈现散发流行,与以往的报道相比阳性率明显下降。     

猪病毒病PCV2、PEDV、TGEV、GAR的复合PCR方法建立及应用

本试验根据John Ellis和Dae S.Song等报道的4对引物建立同时检测猪圆环病毒(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(GAR)4种仔猪腹泻相关病毒的复合PCR方法,并对云南省玉溪市部分县(区)2014-2015年收集的47份腹泻粪便(肠内容物)进行检测,结果显示PCV2、PEDV、TGEV、GAR总阳性率分别为27.66%、55.32%、6.38%、14.89%。与单项PCR检测的符合率达到了100%,试验表明PEDV是导致该地群仔猪腹泻的主要致病因子;该复合PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,省时省力,完全可以应用于临床疾病的快速诊断。     

仔猪流行性腹泻病毒原性调查研究

通过济宁市仔猪流行性的发病情况,找出主要致病因子,对该地区36家猪场的134份病样,进行了猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒-2(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)荧光RT-PCR检测。结果显示:PEDV、TGEV、PCV-2、PRV阳性率分别为73.9%、17.9、21.6%和20.1%,群阳性率分别为83.3%、27.8%、33.3%和25.0%。研究表明:引起仔猪腹泻流行的主要致病因子为PEDV,并伴随TGEV、PCV-2、PRV的混合感染。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

【目的】快速了解猪群感染猪流行性腹泻病毒或免疫猪流行性腹泻病毒相关疫苗后猪群特异性SIgA抗体水平。【方法】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ZJ08株进行纯化，采用纯化的病毒作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的SC(Secretory component,SC)多克隆抗体为标记抗体，通过优化检测条件，建立乳汁中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法。【结果】成功建立了猪流行性腹泻病毒SIgA抗体检测方法。PEDV抗原的最佳包倍浓度为0.6μg·孔^-1，样本最佳稀释比例为1∶5，作用时间1 h;SC标记抗体最适稀释比例为1∶100，作用时间1.5 h。建立的ELISA方法能够特异性检测样本中抗PEDV SIgA抗体，与PoRV(Porcine rotavirus, PoRV)、 TGEV(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)的阳性乳汁均无交叉反应；批内、批间重复试验的变异系数小于10%，具有良好的特异性和重复性。通过临床采集的乳汁样品测定发...     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

【目的】 利用RT-PCR技术建立一种在临床上便于区分猪流行性腹泻病毒（PEDV）自然感染与疫苗免疫毒株的方法。【方法】根据GenBank公布的PEDV ORF3基因序列,在其存在基因缺失区两端的保守区域设计特异性引物,对近两年采集的仔猪腹泻样品进行检测,分析流行毒株的ORF3基因,选择部分阳性样品利用鉴定引物进行RT-PCR扩增,优化其反应体系、Tm值等条件,进行鉴别诊断方法的特异性、敏感性试验,并对大量临床样品进行检测验证。【结果】从新发仔猪腹泻临床样品中克隆获得了11株PEDV的ORF3基因,序列分析显示新分离的9株ORF3基因不存在缺失,属于自然感染野毒,其与疫苗株的核苷酸同源性为95.8%—97.1%。建立的鉴别诊断方法可以特异性扩增PEDV的ORF3基因,其中获得的PEDV自然感染毒株基因片段大小约300 bp ,而弱毒疫苗株则为250 bp左右;该鉴别诊断方法与其他猪源病毒无交叉扩增,其敏感性可达到100TCID50/0.1mL,对仔猪腹泻临床样品检测结果显示,PEDV自然感染的阳性率为65.4%。【结论】 初步建立了基于PEDV ORF3基因的RT-PCR鉴别诊断方法,该方法可以用于区分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株,为PEDV的疫情诊断和流行病学监测提供了一种特异、快速的检测方法。     

猪流行性腹泻病毒GD-A株的分离鉴定及S基因序列分析

【目的】在广东省某疑似发生猪流行性腹泻的猪场中,采集病猪的粪便样品,经RT-PCR检测阳性的样品接种于Vero细胞,以分离猪流行性腹泻病毒.【方法】通过在细胞上的连续传代,直至能稳定增殖.并通过RT-PCR对细胞培养物进行特异性片段的检测,观察细胞病变(CPE)的发生情况,以及间接免疫荧光(IFA)检测猪流行性腹泻病毒的M蛋白,对病毒进行分离与鉴定.【结果和结论】病毒在盲传5代时能观察到典型病变,传至20代时能在Vero细胞上增殖稳定.RT-PCR、CPE与IFA的结果证明,所分离到的病毒为PEDV,并命名为GD-A株.     

闽西地区仔猪病毒性腹泻流行情况调查

分析2014—2016年间猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)在闽西地区的流行情况,以便更好地实施防控工作。采用RT-PCR对闽西地区规模化猪场的135份疑似病毒性腹泻样品进行检测。结果表明,PEDV的阳性检出率为30.37%,TGEV的阳性检出率为13.33%,RV的阳性检出率为11.11%。因此,闽西地区仔猪病毒性腹泻疾病的流行情况须要引起足够重视,采取积极的措施进行预防。     

猪流行性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】建立2种猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体间接ELISA检测方法.【方法】分别以GD-1株PEDV灭活全病毒和原核表达的COE融合蛋白作为包被抗原,确定最佳ELISA条件,检验其重复性、特异性等,并进行临床应用.【结果和结论】确定了2种ELISA方法的最佳条件,重复性试验显示变异系数分别小于4.60%和5.30%,特异性试验检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性,并具有良好的稳定性和较长的保存期.临床样品检测结果显示,223份血清样品总阳性率分别为97.3%(217/223)和98.6%(220/223),2种方法检测的阳性率相近,具有良好的检出率和很高的符合率,为PEDV的抗体检测及流行病学调查提供了一种技术手段.     

辽宁省本溪市猪流行性腹泻调查分析

为掌握猪流行性腹泻(PED)的流行规律,为预防和控制PED提供有利帮助,于2014年1月至2015年03月,在辽宁省本溪市桓仁县、本溪县2个地区临床出现腹泻症状的12个规模化猪场进行了病原检测和流行病学调查。结果表明,PEDV的个体阳性率为66.23%,群体阳性率为100%;猪传染性胃肠炎(TGEV)个体阳性率为16.88%,群体阳性率为33.33%。说明2015年春季辽宁省本溪市猪场仔猪腹泻的主要病原为PEDV。     

广西猪群新发感染猪捷申病的检测诊断

【目的】建立猪捷申病毒(PTV)反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的检测方法,并应用于广西猪群PTV感染诊断。【方法】通过对GenBank中登录的PTV不同血清型基因序列,在5’端保守区设计一对特异性引物,经退火温度摸索及特异性和敏感性试验,建立PTV的RT-PCR检测方法,并对广西部分猪场腹泻病例进行猪捷申病的感染诊断。【结果】所建立的方法能特异性地扩增PTV,不能扩增猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪C群轮状病毒、猪丁型冠状病毒。建立的方法具有较高的敏感性,可检测低至1.16 pg/μl的质粒模板及12.15 pg/μl的核酸模板。应用建立的RT-PCR方法对2018年3月-2019年4月从广西部分猪场采集的235份病猪腹泻粪便进行PTV临床检测,PTV阳性为24份,阳性率为10.21%。【结论】建立的PTV RT-PCR方法简单特异、灵敏度高,可适用于实验室PTV检测诊断。广西部分受检猪场已存在PTV感染,应予以警惕,加强监测与防控。