云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%~100.0%,与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%~98.2%,亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%~80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切,因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。     

黄瓜花叶病毒山东分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

对侵染烟草的黄瓜花叶病毒(CMV)山东分离物(SD1)的外壳蛋白(CP)基因进行克隆和序列分析。根据已报道的黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因序列合成两条寡聚核苷酸引物,用免疫捕捉PCR的方法对黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因进行了扩增。将所得的PCR产物通过T4DNA连接酶连接到pET-22b(+)载体上,并转化大肠杆菌DH5α。序列分析表明:CMV-SD1的CP基因全长657bp,编码218个氨基酸;其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ的分离物有极高的同源性,达92.7%~94.9%;与亚组Ⅱ的同源性仅为59.3%~59.5%;由此将CMV-SD1分离物归属于CMV亚组Ⅰ。     

发根农杆菌介导的抗病毒基因导入番茄转化系统的建立

试验设置基因型、菌液浓度、外植体和方法 4个因素 ,利用发根农杆菌将抗 TMV (烟草花叶病毒 )的 TMV- CP基因和抗 CMV (黄瓜花叶病毒 )的 CMV- CP基因按 L16( 4 4× 2 3)正交表转化番茄。 Km抗性愈伤组织频率的结果表明 ,不同品种、不同菌液浓度转化频率存在着显著性差异 ,而外值体部位、方法之间差异不显著。并已得到 9株转化再生的番茄植株 ,经 PCR检测和EL ISA检测证明 TMV- CP和 CMV- CP基因已导入番茄并表达     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及在病毒检测中的应用

根据已经发表的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白基因的序列,人工合成引物,通过反转录和PCR扩增并克隆了黄瓜花叶病毒辣椒分离物P33(CMV-P33)的外壳蛋白基因,构建到质粒PBS的Hinc位点.重组质粒经Sma酶切后,在0.8%低熔点琼脂糖上电泳,回收克隆的CP基因片段(约0.7kb),用切口平移的方法进行α-32PdATP标记.以此为探针,通过点杂交技术检测提纯的病毒CMV-P33和R1株系、CMV-P33的RNA,及受CMV侵染的辣椒叶片汁液,结果表明:提纯的CMV-P33和R1株系的最低检出量分别为1ng和4ng,CMV-P33的RNA为0.1ng.检测受CMV侵染的辣椒叶片汁液时,最大稀释倍数为100倍.其次,用该探针检测健康辣椒和受烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯Y病毒侵染的烟叶汁液时,检测反应均为阴性.     

抗TMV、CMV转基因烟草的初步选育

将烟草花叶病毒复制酶54 KD蛋白基因构建到质粒pSSZ32.54K,导入根癌农杆菌EHA105株系,用农杆菌介导的叶盘法转化含CMV CP基因的纯合系烟草,获得了含CMV CP基因和TMV RepE基因的转基因烟草,以及只含TMV RepE基因的转基因烟草.以繁殖于新鲜普通烟叶片上的TMV为毒源,机械摩擦接种含双基因的烟草和只含CMV CP基因的烟草.接种15 d后,观察植株发病情况,发现转双基因的烟草无花叶症状出现,而对照植株(只含CMV CP基因)出现花叶症状.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒含量,发现转基因植株体内无病毒积累,而对照植株体内有病毒积累.因此,含RepE基因的烟草对TMV有一定抗性.     

辣椒上CMV亚组ⅠB CP基因克隆与原核表达

[目的]克隆辣椒上黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)基因,诱导CP蛋白表达,为下一步制备高效、特异的抗血清奠定基础.[方法]根据已知的新疆石河子辣椒上的CP基因序列设计引物,克隆CMV CP基因,经测序、Noc Ⅰ/BamH Ⅰ酶切鉴定,成功构建了原核表达载体pET-CMV CP,转化大肠杆菌BL21 DE3,用终浓度为1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测目的蛋白表达.[结果]成功构建了新疆辣椒上CMV CP原核表达载体pET-CMV CP,获得了与预期大小一致的30 kDa蛋白.[结论]新疆石河子辣椒上CMV CP在原核中获得了正确表达.     

根癌农杆菌介导的甜瓜基因转化及其转基因植株的再生

含双元载体pBEWMV的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)　LBA4404感染甜瓜（Cucumis melo）子叶外植体,获得了可育的转基因甜瓜植株。该质粒载体内含选择标记基因npt-Ⅱ（新霉素磷酸基转移酶Ⅱ基因）和WMV-Ⅰ CP基因（西瓜花叶病毒1号外壳蛋白基因）。NPT-Ⅱ酶活性检测、DNA分子点杂交、PCR检测及Southern杂交试验表明,外源的WMV-1 CP基因确已通过农杆菌介导的转化途径导入甜瓜细胞。     

新疆加工番茄上番茄花叶病毒的分子鉴定

从表现花叶、畸形的加工番茄病株上获得分离物xj124,用1 对ToMV CP 基因引物进行 RT-PCR ,扩增得到了689 bp 的特异性核苷酸片段.将PCR产物插入到克隆载体pMD1 8-T中再转化到大肠杆菌TOP10.经限制酶酶切鉴定,重组克隆中含有与PCR 产物大小相同的689 bp 的插入片段.cDNA全序列分析表明,所扩增出的689 bp ToMV CP基因,含1个480 bp开放阅读框架( ORF),编码160氨基酸组成的蛋白,所克隆的基因包含完整的ToMV CP基因.所测得的xj124分离物与国内外已报道的部分ToMV CP基因序列比较,核苷酸同源性高达84.4;～99.8;,氨基酸同源性高达98.7;～100;.因此将该分离物鉴定为番茄病毒病花叶病毒.     

地黄花叶病毒的分子检测

设计了能同时检测Re MV、TMV和ToMV的简并引物,利用RT-PCR的方法对我国不同地区的地黄病毒样品进行了检测。共克隆了25个病毒样品的外壳蛋白(CP)基因,序列测定结果表明,24个病毒样品均是Re MV,其相近病毒TMV未检测到,ToMV仅在一个野生地黄样品上检出,说明Re MV在我国栽培地黄和野生地黄上普遍存在。     

黄瓜花叶病毒病的研究和防治策略

黄瓜花叶病毒是目前对蔬菜生产危害最大的植物病毒病之一。该文就黄瓜花叶病毒的生物学特性,感染植株的方式,感染后植株的表现形式,以及对该病毒的防治措施进行了综述。同时,对科研工作者在防治黄瓜花叶病毒病的过程中所做的研究和探讨进行了论述。     

黄瓜花叶病毒病抗性遗传研究进展

综述了黄瓜花叶病毒的研究进展及黄瓜对黄瓜花叶病毒病的抗性遗传规律和分子标记研究现状,对存在问题进行了分析,并提出了解决问题应该采取的措施。     

应用微机进行苜蓿花叶病毒株系分类的研究

应用主成分分析和模糊聚类法在微机上研究了苜蓿花叶病毒毒株的分类问题。结果表明,H-10分离物与苜蓿花叶典型株系完全相同,属同一株系。Wc分离物自成一株系且与黄化斑块株系最接近。这些结果得到血清方法的证实,并部分得到病毒外壳蛋白AA分析的证实。     

菌克毒克防治烟草花叶病效果研究

研究菌克毒克对烟草花叶病的防治效果,结果表明:菌克毒克(8%宁南霉素水剂内销品)对烟草花叶病有较好的防治效果,平均防治效果达66.7%,可促进烟株的生长,经济效益显著。     

建兰花叶病毒的分子生物学检测

根据建兰花叶病毒外壳蛋白基因的保守序列设计2对引物,采用IC-RT-PCR方法和质粒梯度稀释的方法,研究建兰花叶病毒的分子检测方法和灵敏度.结果表明,从21个建兰花叶病毒的病株样品中均能扩增出与预期大小相同的DNA条带,序列测定和序列同源性分析表明所测定的序列均为CyMV外壳蛋白基因的部分序列,序列同源性均达到89%以上;灵敏度检测结果表明:可检测的最低病毒含量为2.72×10-7 μg/mL.     

黄瓜花叶病毒研究进展

综述了黄瓜花叶病毒(CMV)的生物学特性、基因组、病害防控等方面的研究进展,并对国内外当前研究中存在的问题作了相关探讨。     

太子参中芜菁花叶病毒的RT-PCR检测

建立并应用太子参中芜菁花叶病毒的检测技术。采用RT-PCR技术,设计特定引物从太子参病株中的不同部位扩增特定片段,且进行序列分析和比对。序列比对结果表明,扩增得到的片段为芜菁花叶病毒外壳蛋白基因序列片段,本研究建立了一种简便可靠太子参中芜菁花叶病毒的检测方法,并且从太子参根、茎、叶和花中均检测到病毒目标序列。     

海南香蕉束顶病和花叶病的PCR检测

用CTAB法从感染束顶病（BBTV）的海南香蕉叶片组织中提取DNA，以此为模板分别用特异引物对BBTV的组分Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ进行扩增并测序，结果得到大小分别为607、490和326bp的特异片断；用CTAB法从感染花叶病（CMV）的病叶组织中提取RNA，反转录成cDNA，以此为模板用特异引物进行扩增测序，结果得到大小为557bp的特异片断。用PCR方法可从相当于100ng的叶片组织中检测到BBTV和CMV。     

枣树花叶病毒病的分子检测

【目的】建立枣树花叶病毒病的分子检测方法,追踪检测与分析枣树花叶病毒病田间侵染动态,研究病害防治的关键时间节点,为新疆枣树种植区枣树花叶病毒病的流行监测和早期防治,以及枣树花叶病毒病的高效防治奠定基础。【方法】在前期准确获取病毒全基因组序列的基础上,以病毒基因组序列RNA5为靶标设计序列特异性引物,通过RT-PCR技术进行引物特异性验证与灵敏度检测,优化反应体系,建立枣树花叶病毒病分子检测技术,追踪检测与分析枣树花叶病毒病田间侵染动态。【结果】该检测技术对枣树花叶病毒病检测的最低浓度为4.79 pg/μL,可在叶片显症之前检测到该病毒。5月下旬至6月上旬是预防枣树病毒病的关键时间节点。【结论】建立的枣树花叶病毒病检测技术能够快速准确的检测和鉴定病原,可应用于枣树花叶病田间侵染动态的追踪检测。